Шпаргалка по "Генной инженерии"

31 Самототропин гормонының генін клондау және оның экспрессиясын оптимизациялау.

Инсулиннен кейін ген  инженерлік формакология соматотропин  деп аталатын өсу гормонын бактериялық  клеткада синтездеуді шындап қолға  алды. Адамдарда соматотропин гипофиздің алдыңғы бөлігінде синтезделеді ,оның жетіспеушілігі гипофиздік ергежейлікке әкеледі. Көп жылдар бойы соматотропинді өліктерден бөліп келді.Алайда дамыған  елдерде осындай жолмен бөлінген гормон гипофиздік ергежейлікпен ауратын  адамдардың тек үштен біріне  ғана жеткілікті болады.

«генентек» фирмасының зерттеушілері  Дж.Геддель соматотропинді синтездей  алатын E.coli K12 штамын алды. Алайда алынған  синтетикалық гормонның  N ұшында метиониннің  қосымша қалдығы болды.

Рекомбинантты ДНҚ әдістерін  пайдаланып, организм өсуінің басқа  факторларын (соматостатин ,т.б.) синтездеуге  болады. Соматостатин генінің өнімін E.coli кл.нан лак оперонды қолданып, бөлу мүмкіндігі туды. Қазіргі кезде  соматотропиннің Рекомбинантты  ДНҚ технологиясының мақсаты  өсу гормонының алу. Мыс: гормонның N ұшының алғашқы 150 амин қышқылдарынан  айырылған соматотропиннің туындылары алынды. Бұл туынды организмнің өсуін  жеделдете алады.

Соматотропин молекулаларын  прегормон формасында алу ыңғайлы. Ол үшін жетілген гормон генінің ұшына  реттеуші элементтермен қатар белгілі  тізбекті коделдейтін синтетикалық тізбекті жалғайды. синтетикалық тізбек Геддель әдістемесі бойынша 84 н.ж.құралған және химиялық жолмен синтезделеді. Соматотропиннің не прегормон формасындағы генін E.coli кл.на енгізіп, зоотехния үшін пайдалы препараттар алады. Қазіргі кезде ген инженерлік әдіс арқылы ірі қараның, қойдың, шошқаның, тауықтың Соматотропин гені алынды және E.coli кл.ғы клонын алу және экспрессиясы іске асты.

32 Инсулин гормонының синтетикалық гендері. Адамның инсулин гормонын өндірістік деңгейде, гендік инженериялык жолмен синтездеу.

Инсулин (лат. insulinum insula —  арал) — эндокринді эпителиоциттерден  құралған ұйқы безі аралшықтарының бета-жасушалары (В- инсулоциттері) бөліп, қанға шығаратын  гормон. В- инсулоциттер ұйқы безі аралшықтарының орталықтарында орналасады. Олардың  цитоплазмасында инсулин гормонын түзуге маманданған, безді жасушаларға  тән барлық органеллалар жақ-сы жетілген. Бета—безді жасушалар цитоплазмасындағы  түзілген инсулин дәншелері суда ерімейді, спиртте ериді. Инсулин  — қандағы глюкозаның мөлшерін азайтып, оны адам мен жануарлар бауыры мен бұлшықеттерінде қолданатын күрделі көмірсу — гликогенге айналдырады 

Алғаш рет медицинада ген  инженериясының өнімі - инсулин қолданды. Инсулин ұйқы безінде түзіледі,оның арқасында қандағы глюкозаның артық  мөлшері жануар текті крахмал  гликогенге айналады. Ұйқы безінде  инсулиннің түзілуі  бұзылатын болса ,адам диабет ауруына ұшырайды;глюкоза  гликоген түрінде бөгеліп қалмағандықтан ,қанда жүзім қантының мөлшері  артады.Жалпы есептеу бойынша  дүние жүзінде қант диабетімен ауратын  адамдар саны 60млн.Инсулинге тәуелді  адамдар жылдан жылға көбеюуіне  байланысты қазіргі кезде адамның  ген инженерлік инсулинін бактерия клеткасында өндіру қажеттігі туды.

Адам инсулинінің генін  алғашқы рет 1978жылы «Генентек» фирмасы  синтездей алды.Соматостатин гені сияқты инсулиннің синтетикалық гені  плазмидаға В-галактозидаза генінің соңына енгізілді.Мұнда әрбір бактериялық  клеткада инсулиннің шамамен  100 000 молекуласы синтезделді.E.Coli клеткасында проинсулиннің  биосинтезі іске асты.ол үшін кері транскриптазаның көмегімен иРНҚ-дан оның ДНҚ көшірмесі  синтезделді.

33 Бактериялықмобильді Is - элементтер және транспозондар

Бактерияның генетикалық  ұйымдастырылуының тұрақтылығы  туралыкөзқарастар 1970ж  МГЭ ашылуымен  өзгерді. Бактериялық МГЭ екі  түрлі болуы мүмкін: IS және Tn –элементтер. Екі элементте бактериялогиялық геномда орын ауыстыруға қабілетті, нәтижесінде әр түрлі мұтациялардың  шығу көзі болып саналады. Бұл мутациялар геннің әсерін толық тежеп тастайды. Инсерциялық тізбектер салыстырмалы ұзын емес және ол өзінің транспозициясын  ғана коделейді. IS- элементтердің ұштары инверсиялы қайталанатын тізбектерден құралған. Транспазондар болса өзінің транспозициясын коделейтін гендерден  басқа бактерияның қосымша қасиеттерін  сипаттайтын гендері бар. Транспазондар  және инсерциялық элементтер бактериялық  плазмидалардан жиі табылды., олардың  басым көпшілігі төзімділік R- факторымен байланысқан және де бактериялық  клетканың антибиотиктерге, ауыр металдардың  иондарына төзімділігін анықтауға  қатысады. Сонымен IS-және Tn- элементтерінің орын ауыстыра алу қабілеттілігі  генетикалық инженерия үшін белгілі  маңызы бар.

IS - элементтер (insertion -қою, seguence -кезектелу) транспозаза белогын кодтайтын тендерді тасиды, оның көмегімен IS элементтер ДНҚ-ның әр түрлі бөлімдеріне орын ауыстырады.

Транспозондар (Tns) -инвертирленген IS элементтермен фланкирленген ДНҚ-нын ірі сегменттері. Олардың орын ауыстыруын қамтамасыз ететін гендермен катар, олар химиопрепараттарға тұрактылық гендерін tox - тендер және баска тасымалдайды. IS және Tn-тің орын ауыстыруы клеткалықгеномның орын ауыстыру аймағында транскрипция және трансляцияның тоқталуынан гендердің инактивациясына әкеледі. Кейде олар транскрипйияны активтеуі мүмкін.

34 SV40 – вирусы негізіндегі векторлар.

Жануар клеткасы үшін эукариоттық  векторды дайындаудың негізгі объектісі  – SV40 вирусы. Бұл ұзындығы 5250н.ж. сақиналы ДНҚ-сы бар кішкентай вирус мартышка бүйрегінен бөлінді. SV40 вирусы лямбда бактериофаг сияқты иесінің клеткасының  хромосомасына ене алады. SV40 вирусы негізінде бірнеше бағалы векторлар  құрастырылды. Бұл векторладың біразынан  бір кемшілікті байқауға болады: олар вирионның қалыптасуына әкелгендіктен  иесінің клеткасын жойып жібереді. Сондықтан ғалымдар әр уақытта плазмида сияқты векторларды құрастыруға  талпынады. 1970ж  Берг SV40 вирусының  ДНҚ-сы вирустық емес ДНҚ-дан құралған гибридті ДНҚ молекуласын құрастыруды  ұсынды. Ақырында ол 1980ж   SV40  вирусының  ДНҚ-сы мен E.coli плазмидасының ДНҚ-сынан  тұратын өтпелі плазмидалық векторларды  ДНҚ-сынан тұратын өтпелі плазмидалық  векторларды құрастыра алды. Бұл  векторлар сүтқоректілер клеткасына генді тиімді енгізе алады. Қоянның B – глобин гені ендірілген плазмидалық  векторлар маймыл клеткасында көбейе алады: тек иРНҚ ғана емес, сонымен  қатар B – глобиннің өзі синтезделді. SV40 вирусы Polyomavirus туысы Polyomaviridae тұқымдасына жатады. Ұсақ врус және оның сақиналы қостізбекті ДНҚ-сы қожайын клеткада репликацияланады. SV40 вирусы макака резус бүйрегінің біріншілік культурасынан бөлінген. SV40 вирусының промоторы күрделі. Ол эукариот промоторына тән транскрипция инициациясы нүктесінен 30 пн арақашықтықта ТАТА-бокс(блок Хогнесс)  бар. Қосымша элементтер 115 пн арақашықтықта орналасқан және 21 пн ұзындықтағы үш тура қайталануларды құрайды. Бұл облыспен SP1 клеткалық фактор байланысады. Нәтижесінде SP1 басқа да белоктармен байланысады. Сосын РНК-полимеразаII транскрипциясына қажет комплекс түзіледі. SV40 вирусы ДНҚ-сы негізіндегі литикалық векторлар. Орынның тар болып қалуына байланысты SV40 вирусының ДНҚ-сында перестройкалар мен делециялар байқалады. Бірақ вирус тіршілігін жоймайды. SV40 вирусы дефектті болуы мүмкін. Гибридті ДНҚ вирустық капсид түрінде қаптаоуы үшін оның мөлшері вирус геномының 70-100% құрауы қажет. Сондықтан да гибридті вирус ұрпағын алу үшін ДНҚ-ң бөтен фрагментін вирусты ДНҚ молекуласынан енгізу қажет. Онда рестриктаза көмегімен белгілі бір аудан делетирленген. Орналастыру кезінде басқа да вирустық функцияларды вирус-көмекші көмегімен комплементирлеу керек. SV40 вирусы ДНҚ-сы негізіндегі мұндай типті векторлар литикалық векторлар деп аталады. SV40 вирусы негізіндегі литикалық емес эписомдық векторлар. Мұндай типті векторлар бифункциональды плазмидалар, яғни челночты. Олар E.coli клеткаларында репликацияланады. Сүтқоректілер клеткаларында репликациялана алмайды, сондықтан плазмидалар геномға интеграцияланады. Сондықтан да оларды эписомалық векторлар деп аталады. Мұндай плазмидалар бүтін геномның векторлық плазмидасын немесе SV40 вирусының ДНҚ фрагментін қайта құрастыра алады. Құрастырылып жатқан вирустық фрагмент нативті вирустық репликатор, бір немесе екі промотор, кейбір жағдайларда сплайсингтің вирустық сигналын және мРНК-ның полиаденилінен тұрады. 1980 жылы зерттеулер нәтижесінде бактериалды плазмидада эукариоттық гендердің экспрессия деңгейін төмендететін тізбек бар екені анықталды.   SV40 вирусы негізіндегі трансформациялаушы векторлар. зақымданба,ған ертедегі SV40 вирусының гені бар ДНҚ гибридті молекуласын трансформациялаушы вектор ретінде қолдануға болады. SV40 вирусы үшін пермиссивті емес клеткаларда ДНҚ молекуласы хромосомаға интеграцияланады. Челночты плазмидаға немесе вирустық ДНҚ-ға орналасқан бөтен гендер коптеген копиялар түрінде клетка геномына интеграцияланады. 

35.Клондалуға арналған  гендерді промоторға қатысты  бір бағытта орналастыру.

Реттегіш промоторларды  қолданған өте ыңғайлы болып  келеді.Үлкен бактериялық масса  алынған кезде өзге протеин синтезі  жүреді.Бұндай промоторларға термосезгіш  промотрлар рL жатады.Ол бактериофактағы  бірнеше гендердің экспрессиясына жауапты болады.Осы промотордың  қозғалысын шектейтін белок-репрессор 31С та активті, бірақ 38С та активті  емес болады.Сол себептен,бактериялар  инкубация кезінде  өзге ген  31Ста  экспрессияланбайды.Жоғары температурада  pL-репрессор инактивтенеді, бұл кезде  реттегіш элементтер көбірек болады.Ол өзге белоктың синтезіне алып келеді. Онын молшері бактериалды клеткада синтезделетін протеин молшерінен жалпы 10% курайды.Плазмида құрамындағы гендердің эффективті экспрессиялануы басқа да мықты реттегіш промотрларға байланысты.Мысалы:

1) Триптофан оперонның  Тгр-промоторы,ол репрессормен реттеліді, 3-индолилуксус қышқылын  немесе  триптофанның жетіспеушілігін реттей  алады; 2)Лактоза оперонының  Lac-промоторы,  ол да сол сияқты реттеледі  және лактоза субстратын индуцирлейді;3) промотордың  trp-lac(tac)гибриді, ол 1ас-репрессормен  реттеледі.Трансляцияның эффектифтілігіне  Шайно Дальгарно реттілігі мен  одан иницирлеуші кодонга дейінгі  арақашықтық әсерін тигізеді.Әдетті  бұл тізбекті керекті арақашықтықта  вектордың құрамына иницирлеуші  кодонмен бірге қосады.Бұндай  вектордың экспрессиялануынан гебридті  белок пада болады. Оның құрамында  прокариоттық геннен тұратын  бірнеше N-kohцевых аминоқышқыл  қалдықтары болады.Прокариоттық  ген иницирлеуші кодон мен  реттегіш элемент көзі.Гибридті  белоктар көбінесе қалыпты болады,ал  химиялық және ферментативті  өңдеу белоктың эукариоттық бөлігін  көрсетеді. Рекомбинант ДНК азықтылығының  тиімділігіне байыпты дәрежеде  осы ДНК көшірмесінің саны  ара есеп бас торды әсер  етеді.Экспрессиялаушы геннің өте  активті болуы плазмидының көшірімділігіндей  өсе береді.Сонымен,көп көшірмелі  плазмидаларды қолдана отырып,өнімдегі  керекті белоктың жоғары синтезін  алуға болады.Әдетте қолданылатын  векторлар (pBR 322 және басқа) ол клетканың 20—50 көшңрмесін сақап тұрады.Қазір ғалымдардың қолында температураға төзімді мутантты плазмидалар бар.Олардың бір клеткасында бір,екі мыңдаған клеткалар көшірмелері бола алады,Және ол клеканың ешқандай өмірлік цикліне зақымын тигізбейді.Осылай жоғары продукциялы плазмиданың генін бактериялдық штамы жогары продуценттерден  алуға болады.Бұл биотехнологиядағы керекті,ол экономикалық жағынан да тиңмдң болады.

36. Тізбекті полимеразалық реакция,оның гендік инженериядағы қолданылуы.

Полимеразалық тізбектік  реакция(ПЦР) - бұл амплификациялық метод in vitro жағдайында,аз уақыт ішінде бір геннің миллиондаған қайталамаларын алуға негізделген жүйе.Бұл метод 1985 жылы К.Мюллиспен зерттеліп(биотехнологиялық корпорация “Cetus”,США) тек 1988 ж кең тарады.Р.Сайки ПЦР жүйесінің жұмысын және қолданысын сипаттады.ПЦР-ғасыр жаңалығы атанып,1993 Нобель премиясымен марапатталды.Сонымен қатар “Адам  геномы” программасын жүйелеп,клиникалық диагостикада қолданыс аясына еніп,көптеген ауруларды емдеуге ықпалын тигізді. ПЦР жүйесінде ДНҚ бөліктерінің амплификациясына термо тұрақты ДНҚ полимеразаны термофильдік бактериядан алып Thermus aquaticus қолданады.Taq поимераза 4 түрлі дезоксирибонуклеозид3фосфат негізінде және Праймер ДНҚ комплименарлық жұптарының синтезін жүзеге асырады.

1- Термикалық денатурация  процесі ДНҚ қос тізбегінің  ширатылу процесі жүреді 93- 95 С  градуста бұл коплиментарлық  тізбектің бөлінуіне алып келеді.

2-Бұдан соң пробаларды 60 Сградуста салқындатады бұл  праймердің бір тізбекті дезоксиолигонуклеотидпен  байланысына және  Taq-полимеразаның  жұмысына ықпал етеді.

3-Элонгациялық кезең.72С  градуста ДНҚ полимераза негізінде   тізбектердің ұзаруына негізделген.

Праймер

Праймер геннің тек 3”соңына  комлиментарлы болуы керек.МРНҚ ға Праймерді 2 мақсат үшін қосады.

1-ДНҚ полимеразаның жұмысының  басталуына.

2-Керекті көшірме ауданына  келгенде ДНҚ полимеразаның жұмысын  тежеу үшін.

Схемадан ПЦР дің циклдік  реакция екенін көруге болады.1 және 2 циклдерде пайда болған ДНҚ қайталамалардың (ампликондар) амплифицирлік геннің шекарасына сәйкес келмейтінін аңғаруға болады.Бірақ 3 циклде ампликон ұзындықтары  қалыпты күйге ауысады.

Циклді көп қайталау нәтижесінде  ДНҚ спецификалық фрагметтерінің қайталамалары  көбейіп,элекрфорез көмегімен идентификациялауға болады.

Амлификациялық циклді 30-40 рет,1,5-3 сағатта ДНҚ фрагметтерінің миллиондаған қайталамаларын алуға  болады.Бірақ циклді көбейткеннен эффект азайады себебі ПЦР дің жоғарғы  өнімділігі 20-25 цикл кезеңдерінде ғана жүзеге асады.Одан кейінгі циклдерде  дезоксирибонуклеозид3фосфаттың прамердің, Taq-полимеразаның жұмысы нашарлайды.

Реакция компоненттері

Полимеразалық тізбекті реакцияларды жүзеге асыру үшін қарапайым жағдайда келесі компоненттер қажет:

Амплификациялауға қажет  ДНҚ фрагменті бар – ДНҚ  марица;

Қажетті ДНҚ фрагментінің әртүрлі ұштарына комплементарлы –  екі праймер;

Полимеразалық реакцияларды катализдейтін термотұрақты фермент  – ДНҚ-полимераза; ПТР-ді жүзеге асыру  үшін қажетті ДНҚ-полимераза жоғары температурада да өзінің активтілігін сақтап қалуы керек. ПТР-ге қажетті  ДНҚ полимеразалар термофильді  бактериалардан бөлініп алынған: Thermus aquaticus(Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus(Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei(Pwo-полимераза) және т.б.

Дезоксирибонуклеозидтрифосфаттар (dATP, dGTP, dCTP, dTTP);

Полимеразаның жұмысына қажетті Mg²⁺ ионы.

Реакцияға қажетті жағдайларды (рН, ерітіндінің иондық күші) қамтамасыз ететін – буфер ерітіндісі. Құрамында  тұздар мен бұқаның қан сарысу альбумині болады.

Сондай-ақ ПТР реакцияларының ингибиторлары ретінде пирофосфаттар  қолданылуы мүмкін.

37.Рекомбинантты белоктарды  эукариот жуйесінде алу артықшылықтары.

Барлық рекомбинантты  белоктар адмнның организміне арналғандықтан прокариоттар жүйесінде жасау тиімсіз. Өйткені оларда глиголиздену және жеке аминқышқылдардың модификациялану  процесстері жүрмейді, сонымен қоса жалпы биосинтез қарапайым болғандықтан күрделі адамға сәйкез келетін белокты шығару өте қиын. Шыққан белоктың өзі активтілігі өте төмен болып келеді. Эукариоттарда бұл процес анағұрлым жеңіл, өйткені барлық процестер адмның клеткасына сәйкес постранскрипциялық және пострансляциялық модификациялары бір. Дисульфидтік байланыстар түзетін дисульфидизомераза ферменттері бар. Сонымен қоса белоктар посттрансляциялық ыдырауға ұшырайды,  яғни пролитикалық процесингке ұшырауға тиіс. Прокариоттарда жоқ гликолиздену процессі жүреді, яғни гликопротеинге айналуы.Мысалы O,N гликолиздену, O серин үшін , N аспарагин үшін. Және де прокариоттарда кездеспейтін жаңадан синтезделетін белоктардың құрамындағы жеке аминқышқылдардың модификациялануы, яғни сілтіленуі, фосфорлануы, метилденуі т.б.

38. Өсімдіктер гендік инженериясы. Ti- плазмида және оның сипаттамасы.

Өсімдіктер қоршаған ортаның  көптеген қолайсыз факторларының әсеріне: жоғары және төмен температура, ылғалдың жетіспеушлігі , топырақтың тұздану, ауаның  газдануы, минералдық заттардың жетіспеушілігі немесе керісінше, шектен тыс көбеуі т.с.с. тап болады.  Бұл факторлар  өте көп болғандықтан олардан  қорғану жолдары да әртүрлі-  физиологиялық  қасиеттерден  құрылымды өзгерістерге дейін. Өсімдіктің қандай болмасын стресс факторына төзімділігі көптеген гендерге байланысты. Сондықтан, өсімдіктің бір түрінен екінші түріне барлық төзімділік  белгілерін толығымен  тасымалдап енгізу тек қана бір әдіспен  әрине мүмкін емес. Кейбір жағдайда гендік инженерия  арқылы өсімдіктердің  төзімділігін арттыруға болады. Мыс, абиотикалық факторларына  өсімдіктің  метоболиттік реакциясын бақылайтын  жеке гендермен  әрекеттер жүргізуге  жағдай бар.  Қоршаған ортаның жағдайларына  жауап реакцияларының физиологиялық, биохимиялық, генетикалық негіздерін, одан әрі зерттеулер гендік инженерия  әдістерін қолданып, төзімді өсімдіктерді шығаруға мүмкіндіктер береді. Генетикалық  өзгерілген немесе генетикалық модификацияланған  өнімдер- бұл ДНҚ-на ерекше табиғаттан берілмеген ген енгізілген өсімдіктерден  алынған өнімдер, оның арқасында  олардың бойында әртүрлі жаңа қасиеттер пайда болады.