Шпаргалка по "Генной инженерии"

«Гендік инженерия» пәні бойынша емтихан  сұрақтары

 

1. Эукариот гендерінің құрылымы. Реттегіш және структуралық бөлімдер, олардың ген экспрессиясындағы рөлі.
2. Прокариот гендерінің құрылымы. Реттегіш және структуралық бөлімдер, олардың ген экспрессиясындағы рөлі.
3. Реттегіш промоторлар: lac-, trp-, tac-, pL- және Т7. Олардың сипаттамасы.
4. Гендік инженерияның пайда болуының алғы шарттары. Рекомбинантты ДНҚ-ны клондаудың жалпы бейнесі.
5. Гендік инженерияда кеңінен қолданылатын ферменттер және олардың сипаттмасы.
6. Рестрикциялық эндонуклеазалар. Олардың классификациясы.
7. Днқ-полимереза. Оның құрылыс ерекшеліктері және негізгі қасиеттері.
8. ДНҚ тізбегін анықтаудың химиялық әдісі (Максам-Гильберт).
9. ДНҚ кесінділерін М13 бактериофагында клондау және сиквинс әдісі (Сэнгер әдісі).
10. Бактериялық плазмидаларға жалпы түсінік. Плазмидалық векторларға қойылатын шарттар. pBR322 плазмидалық векторы.
11. Транспозондардың геномда жыджуының механизмдері. Транспозаза және оның репрессорлары.
12. Антиденелердің структуралық ерекшеліктері. Антиденелердің V- және C- сегменттерінің генетикалық бақылануы.
13. L-бактериофагының литикалық және лизогениялық даму жолдары. L-бактериофаг геномы негізіндегі векторлар.
14. Космидті векторлардың конструкциясы.
15. Ұзын ДНҚ кесінділерін клондауға арналған жасанды хромосомалар (ҮАС-вектор).
16. РНҚ-лы онкогендік вирустардың (ретровирустар) ұйымдасу ерекшеліктері. Онкогендік вирустар негізіндегі векторлар.
17. Рекомбинантты ДНҚ-ны прокариот жүйелеріне трансформациялау әдістері.
18. кДНҚ синтезі және оны клондау. Кері транскриптаза ферментіне сипаттама және олардың қолданылуы.
19. Селективті және репортерлы гендер негізінде трансформацияланған клеткаларды сұрыптау.
20. Трансформацияланған клеткаларды айқындау. Саузерн және Нозерн блоттинг әдістері.
21. Трансгендердің экспрессиялануын айқындау. Иммуноблоттинг. Бірінші және екінші реттік антиденелер.
22. Прокариот жүйесінде клондалған гендердің экспрессиясын оптимизациялау.
23. Эукариот жүйесінде клондалған гендердің экспрессиясын оптимизациялау. Қойылатын шарттар.
24. Трансгенді жануарлар алу әдісіне жалпы сипаттама.
25. Ашытқы жүйесіндегі жасанды хромосомалар.ҮАС векторы. Ашытқы жүйесіндегі эписомалық вектолар.
26. Ашытқы жуйесі. 2 мкм плазмидасы негізіндегі экспрессияланушы векторлар (интеграцияланушы векторлар).
27. Өсімдіктерді агробактериялар арқылы трансформациялау.Трансгенді өсімдіктер.
28. Ті-плазмидасы сипаттамасы .мутанттары.
29. Ті-плазмидасы негізіндегі векторлар
30. Рекомбинантты ДНҚ технологиясының практикада қолданылуы. Гендерді өндірістік деңгейде клондау.
31. Самототропин гормонының генін клондау және оның экспрессиясын оптимизациялау.
32. Инсулин гормонының синтетикалық гендері. Адамның инсулин гормонын өндірістік деңгейде, гендік инженериялык жолмен синтездеу.
33. Бактериялықмобильді Is - элементтер және транспозондар
34. SV40 – вирусы негізіндегі векторлар.
35. Клондалуға арналған гендерді промоторға қатысты бір бағытта орналастыру.
36. Тізбекті полимеразалық реакция,оның гендік инженериядағы қолданылуы.
37. Рекомбинантты белоктарды  эукариот жуйесінде алу артықшылықтары.
38. Өсімдіктер гендік инженериясы. Ti- плазмида және оның сипаттамасы.
39. Жылжымалы генетикалықэлементтержәнеолардыңгендікинженериядақолданылуы
40. Өсімдік клеткаларын және протопластарды трансформациялау әдістері.

 

1. Эукариот гендерінің құрылымы. Реттегіш және структуралық бөлімдер, олардың ген экспрессиясындағы рөлі.

Эукариот генінің құрылысы: Эукариоттарда ori ауданы бірнеше болады.Эукариоттарда ДНҚ polб ,ДНҚ pol в, дНҚ pol г т.б

Эукариоттардың ДНҚ сызықты,яғни бос шеттері бар. Осыған байлвнысты эукариоттарда 5’ соңының проблемасы бар.Оказаки фрагментінің ұзындығы 200 болып келеді. Геномы моно цистронды.Гендерінің структуралық құрылымы мозайкалы.Эукариоттарда ДНҚ полимеразаның үш түрі бар:

РНҚ pol I --рРНҚ

РНҚ pol II--мРНҚ

РНҚ pol III—тРНҚ

Эукариоттар 40 s +60s=80s суббөлік түзеді.

Эукариоттарда екі аймақ  белгілі: құрылымды және реттелуші.

Олар транскрипция басында  сайтпен бөлінген. Құрылымды аймақ  құрылымдық гендермен қамтылған. Ген  кодталынған бір ізділікті экзоннан және кодталынбаған бір ізділікті  интрондардан тұрады. Интрондар ұзындығы 80-1000 және оданда көп нуклеотидтерден  тұрады. Интрон консенсусті аймақпен шектелінген және консервативті, оларға нақты бір ізділік міндетті емес. Бұл процесс интрондардың үзілу  механизмдерімен байланысты. Интрондар  саны 2-50 көлемінде.

Геннің экспрессиялы реттелуі – бұл ДНҚ-ның әртүрлі бөлігіне немесе нүкте аймағына (сайттарға) белгілі өнімдер, мысалы белоктың спецификалы өзіндік қосылуын, транскрипцияның басталуы деп атаймыз. Сонымен гендердің экспрессиялы реттелуі дегеніміз қоршаған орта өзгерістеріне организмнің бейімделуі.

Реттеуші  аймақ 2- элементтерден тұрады: 1-ші элемент базалы экспрессияның реттелу деңгейін қамтыйды /промотор/.

2-ші –қосымша экспрессиялы реттелу деңгейі.

Промотор транскрипцияның  басталуындағы нүкте /сайт/ алдында  орналасады.

Базалы экспрессиялы реттелу деңгейі 2-і элементтен тұрады: ТАТА – бокс және ЦААТ – бокс. ТАТА – бокс РНҚ полимеразаны транскрипция инициациясының сайтына бағыттайды және м-РНҚ синтезінің басталу нақтылығын анықтайды. ЦААТ – бокс транскрипция жиілігін бақылайды. РНҚ полимераза промоторды тану үшін ТАТА –фактор – үлкен ақуызды комплекс қажет. ТАТА – бокс және ТАТА – фактор бірнеше рет қолданатын транскрипциялы комплекс түзеді.

Базалы реттелу  элементтерінің жалпы қасиеті: олар ақуызды факторлар немесе реттеуші белоктармен қосылғанда жұмыс халінде болады. Реттеуші ақуыздар промотор алдындағы аймақпен қосылады. Бұл ДНҚ- бөлігінде 100 жұп нуклеотидтер болады. Промотор алдындағы аймақта реттелуші ақуыздар сайттармен байланысқан.

Реттеуші ақуыздар гендермен  кодталынған бір хромосомада  немесе көрші хромосомада орналасқан. Бірінші жағдайда реттеуші цис-типке, ал екінші –транс типке жатады.

Реттелудің қосымша деңгейі  ДНҚ бір ізділігінің 2-і кластары кіреді. Бірінші класс –энхансерлер, ал екіншісі – сайленсерлер.

Энхансерлер және сайленсерлер әсерлері спецификалық өнімдер немесе эффекторларға тәуелді емес, олар базалы элементтердің реттелуіне әсер етеді.

Кейбір гендердің адаптивті  реттелуіне: гормондар, жылу шок, металл әсері, кейбір химиялық токсиндерге  жауап береді.

РНҚ процессингі және синтезі.

РНҚ синтезі көп этапты күрделі процесс, энергияны қажет етеді.  3-кезеңнен тұрады:

1.  Инициация; 2. Элонгация; 3. Терминация.

Инициация кезінде РНҚ полимераза промотормен қосылып ДНҚ шынжырын тарқатады. М-РНҚ бір шынжырлы. ДНҚ –да РНҚ-ның орналасуы комплементарлық принциппен өтеді. Мұндай бірізділік трансляцияның терминациялы кодоны деп аталынады.

ДНҚ транскрипциялы аймағы, яғни промотор мен терминтатор арасында орналасса транскрипция бірілігі немесе транскриптоном деп аталынады. ДНҚ  транскрипциялы аймағы, яғни промотор мен терминтатор арасында орналасқан транскрипция бірлігі немес транскриптон деп аталынады, ал түзілген РНҚ алғашқы  транскриптат делінеді.

Прокариоттарда алғашқы  транскриптатта РНҚ-ның көшірмесі  бірнеше гендерден тұрады, ал эукариоттарда  – біреу ғана.

РНҚ полимеразаның бірнеше  типтері белгілі. РНҚ-ның транскриптаттың 5^/ - соңы синтезделінеді, содан кейін кэпирленеді. Кэпирлену – бұл белгі нуклеотидтердің бірізділігінің қосылуы. Кэпирлену қызметі – РНҚ транскриптатаны бұзылудан қорғау және рибосомамен байланысады. Одан трансляция басталады,сосын кэп алынып тасталынады.

Элонгация кезеңі немесе РНҚ – транскриптатының ұзаруы. Бұл кезде ДНҚ тарқатылып және нуклеосома бұзылады. Синтез жылдамдылығы – секундына 30 нуклеотидтер. Элонгация – элонгациялы ақуызды факторлармен бақыланады. Терминация – РНҚ транскриптат синтезімен бітеді. Стоп-кодонға терминациялы ақуызды фактор қосылады. Бұл кезде транскриптаттың 3^/ - соңына 100-200 аденил қышқыл қалдықтары қлсылып поли А- құйрық түзеді. Поли А – құйрық РНҚ транскриптаттың деградациядан қорғайды және оның цитоплазмаға тасымалдануына жеңілдік жасайды. Бірінші РНҚ транскриптат нуклеоплазмада сақталынуы мүмкін немесе сплайсингке ұшырайды.

Ген – бұл күрделі функциональді  белсенді бірлік, РНҚ молекуласының  синтезін реттеуге белгіленген.

РНҚ сплайсингі.

Бірінші РНҚ транскриптат бөліктерге гетерогенді ядролы нуклеопротеинді  бөлік қосылады, бұл процесс гя-РНП-бөлк деп аталынады.

Оларда РНҚ ұзындығы 5000 нуклеотидтерге дейін және ақуызды  остьке оратылған. Гетерогенді РНП  – бөліктері экзондар мен интрондарға  қосылып, содан кейін жұптарымен байланысып агрегатты немесе сплайсосом түзіледі. Сплайсосом құрамына аз ядролы РНҚ кіреді. Қызметі интрондарды  үзу. Интрондардың үзілуі жоғары дәлділікпен  жүреді. РНҚ сплайсинг процессінде  спецификалы лассо-тәрізді құрылым  түзіледі. Олар интрондарды босатып  экзондарды тігеді. Процессинг және сплайсинг  РНҚ транскриптат: кэпирлі қайталану, инициация кодоны – метионин, экзондар, стоп-кодон және поли А соңынан тұрады. Мұндай м-РНҚ цитоплазмаға өтіп, белоктың синтез процесіне қолданылады.

Альтернативті сплайсинг. Реттелу  механизмі зерттелінбеген. Альтернативті  сплайсинг мәні, бір ғана бірінші  транскриптаттан әртүрлі м-РНҚ  экзондардың әртүрлі бір ізділігін  тігу арқылы алуға болады.

2. Прокариот гендерінің құрылымы. Реттегіш және структуралық бөлімдер, олардың ген экспрессиясындағы рөлі.

Геннің экспрессиялы реттелуі – бұл ДНҚ-ның әртүрлі бөлігіне немесе нүкте аймағына (сайттарға) белгілі өнімдер, мысалы белоктың спецификалы өзіндік қосылуын, транскрипцияның басталуы деп атаймыз. Сонымен гендердің экспрессиялы реттелуі дегеніміз қоршаған орта өзгерістеріне организмнің бейімделуі.

 

Прокариот гендерінің экспрессиялы реттелуі

1961 жылы Жакоб және Моно  оперон моделін ұсынған болатын.  Олар ішек таяқшасындағы лактоза  метаболизмін зерттеген болатын.  Ол үш ферментпен іске асады  және ұш құрылымды гендермен  кодталынады. Құрылымды гендердің  тізбектелініп орналасқан және  физикалы өзара байланысқан.

Гендердің тізбектелініп  орналасуы бір ғана реттеуші орталықтың көмегімен, барлық үш құрылымды гендерді экспрессиялы реттеуге көмектеседі, үш құрылымды гендер туралы хабар РНҚ-ның  бір молекуласында жазылынған. Бұл  процесс полицистронды м-РНҚ деп  аталынады. Полицистронды м-РНҚ тек  прокариоттарға ғана тән.

Реттеуші орталықтың құрылысы. Реттеуші орталық құрамына ген кіреді және әруақытта жұмыс халінде болады және экспрессия спецификалық реттелуге ұшырамайды, сондықтан конститутивті деп аталынады. Бұл геннің өнімі – ақуыз - репрессор. Ақуыз - репрессор 4 субьбірлікті молекула.

Конститутивті геном және құрылымды гендер арасында оперативті локус немесе оператор және промотор болады.

Оператор – бұл ДНҚ бөлігі, ұзындығы 27 жұп негізді. Промотор, оператор және құрылымды гендер қосындысы оперон деп аталады.

Прокариоттарда  гендердің реттелуінің 2-і типі белгілі: позитивті және негативті.

Негативті бір ізділікті реттелу: конститутивті ген әруақытта белок – репрессорды түзіп отырады. Бұл репрессор лактоза жоқ кещде операторға отырып РНҚ-а полимеразаның промоторға қосылуына кедергі жасайды. Бұл кезде полицистронды м-РНҚ- ның синтезі жүрмейді.

Егер клеткаға индуктор (лактоза) енсе, ол репрессормен қосылып, оның конформациясын өзгертіп, операторды босатады.

Бос оператор – бұл сигнал, яғни РНҚ полимеразаның промоторға қосылуына көмектеседі, және полицистронды м-РНҚ транскрипциясы басталады. РНҚ полимеразаның промотормен қосылуының міндетті жағдайын қолдаушы, циклді АМФ және катаболитті гендердің белсенді ақуыздарының болуы. Прокариоттарда м-РНҚ- синтезі аяқталынбай жатып, ақуыз синтезі басталынады, және лактоза өзіндік ыдырайды. Лактоза концентрациясы төмендегенде репрессор босаңсып, оператормен қосылып м-РНҚ синтезіне бөгет жасайды. Мұндай оперон типі индуцибельді деп аталады.

Оперонның басқа варианты – соңғы өнімдер реакциясының реттелуі (эффектор) болып табылады. Бұл кезде реттеуші-ген белсенсіз ақуыз-репрессор синтезін анықтайды.

Соңғы өнімдер реакциясы  белсенсіз репрессормен байланысып, оларды белсенді халге алып келеді. Репрессор оператормен байланысып құрылымдық гендердің транскрипциясын бөгейді және бұл процесс эффектор концентрациясы төмендегенге дейін жүреді. Содан кейін эффектор репрессордан ажырап, репрессор төмендеп оперон жұмысы жаңарады. Оперонның мұндей типі репрессивті деп аталынады, мысалы: триптофан метаболизмінің реттелуі осылай жүреді. Прокариоттарда гендердің экспрессиялы реттелуі транскрипция деңгейінде өтеді.

Прокариоттарда гендерді қосатын өнімдерді индуктор, ал ажырататын өнімдер-репрессор деп аталынады.

Индуктор-бұл спецификалық реттелуші сигнал немесе бір реакцияның соңғы өнімі.

Репрессор – бұл белок. Ген, экспрессия индуктордың әсеріне  деген жауапты күшейтеді. Бұл  процесс индуцибельді ген деп  аталады. Эукариот гендерінде индуктордың  орнына реттеуші термині қолданылады. Реттеуші болып: белок, белсенді оттегі, металл саналады.

РНҚ процессингі және синтезі.

РНҚ синтезі көп этапты күрделі процесс, энергияны қажет  етеді.  3-кезеңнен тұрады:

1.  Инициация; 2. Элонгация; 3. Терминация.

 

Инициация кезінде РНҚ полимераза промотормен қосылып ДНҚ шынжырын тарқатады. М-РНҚ бір шынжырлы. ДНҚ –да РНҚ-ның орналасуы комплементарлық принциппен өтеді. Мұндай бірізділік трансляцияның терминациялы кодоны деп аталынады.