Шпаргалка по "Генной инженерии"

қажет генді тауып анықтаудың тағы фенотиптік және иммунологиялық екі әдісі белгілі.

21.Трансгендердің экспрессиялануын айқындау. Иммуноблоттинг. Бірінші және екінші реттік антиденелер. Антидене иммундық жүйемен шығарылатын ақуыздар, олар бөтен патогендік агенттердің, ақуыздардың (антигендер) әсерін тежейді. Иммуноблотинг — мунохимия әдісі, кейінгі кездерде антидененің бөлек антигендермен байланысын іздеуге қолданылып жүр. Бұл үшін антигендерді полиакриламид гелінде электрофорезбен бір-бірінен бөледі, бөлек антигендерді гелден арнайы жинақтағышқа кешіреді, оған зерттелетін: қан сарысуын қосады да, байланысқа түскен антиденелерді иммунофермент әдісімен анықтайды. Бұл ғылыми зерттеулерде де және вирус ауруларына диагноз қоюда да қолданылады (Мысалы адамның иммунды тапшылық вирусын зерттеуде). Иммуноблотинг алдын ала белгілі емес көп компонентті қоспада құралатын антигендерді идентификациялау жәнесипаттау үшін иммуноблотингті қолданады. Иммуноблотингті жүргізгенде антигендердің күрделі қоспасын бастапқы гель- электрофорезге жібереді, содан соң фракцияланған паптидтерді арнайы антисарысу көмегімен жеке паптидтерді идентификациялау үшін нитроцеллюлозада бетіне ауыстырады.Натрий децилсульфаты бар немесе изоэлектірлік фокустау үшін гельде алдын ала бөлу жүргізіп, антигендердің көлемі жөнінде және изоэлектірлік нүктесі туралы мәлімет алуға болады. Сонымен қатар олардың арасындағы ұқсастық туралы да деректер алуға болады.  Кейбір  жағдайда гельдегі электрофорез және блоттинг  процедурасы нәтижесінде антигеннің кейбір эпитоптары бұзылып арнайы антигендер мен антиденелердің байланысу қабілетін жоғалтатындай етіп денатурациялайды. Мұндай жағдайда блотинг орнына яғни қандай антиген антиденелермен байланысқанын бекіту үшін иммунопреципитатция қолданған жөн. Берілген әдісті ерігіш және мембрандық антигендерді анықтау үшін қолдануға болады.

Иммунологиялық әдіс геннің  өнімі белок құрамы мәлім болса  қолданылады.Бұл әдіс белоққа антизаттар синтездей алу мүмкіншілігіне сүйенеді.Алдымен  рекомбинатты молекулалар бар клетка шоғырын  агардың үстінде лизиске  ұшырайды, Онан соң поливинил пластинкасына  антизаттарды бекітіп, антиген ( геннің өнімі) антизат байланысу реакциясын жүргізеді. Антизаттар тек өзіне  сәйкес белоктармен ғана байланысады. Перти шынысындағы белоктың  яғни өажет геннің орнын радиоактивті элементпен белгіленген антизаттар арқылы  табады. Полимерлі пластинкада радиоактивті бөліктердің орналасу тәртібі бойынша  активті гендері бар бактериялар шоғырын табуға болады.

22. Прокариот жүйесінде клондалған гендердің экспрессиясын оптимизациялау. Промотор күшті және әлсіз болады. Геннің ең маңызды қасиеті- экспрессияға қабілеттілігі.Бұған әртүрлі генетикалық элементтер жауап береді.Ал біздің мақсатымыз оларды генді алып жүретін векторлық молекулаға орналастыру

Күшті промотор мРНК-ның синтезін жиі инициациялайды.Бір жағынан  промотор реттелетін (индуцибельді) және реттелмейтін (конструктативті) болады. Индуцибельді қоршаған ортаға тәуелді  болады, ал конструктативті үздіксіз геннің экспрессиялануын қамтамасыз етеді. Мысалы β-лактамазаның промоторы реттелмейді, бірақ күшті. Мұндай промоторларды  қолдану ыңғайлы. Себебі белоктың көп  мөлшері бактериялардың өсуін тежейді, сондай-ақ рекомбинантты

ДНК-ның интенсивті транскрипциясы плазмиданың репликациясын тежейді.Осындай  жағдайларды алдын алу үшін реттелетін күшті промоторларды қолданады. 

Кейбір плазмидалық векторлардың промоторы температураға сезімтал белоктық өнімнің репрессор генімен  реттеледі. Белок-репрессор белгілі  бір температурада активтенеді  және промотор қызметін кодтайды. Температураны 420С дейін көтерсек, промоторды қосуға және керекті белоктың гиперпродукциясын  ала аламыз

23.Эукариот жүйесінде клондалған гендердің экспрессиясын оптимизациялау. Қойылатын шарттар.Геннің экспрессиялы реттелуі – бұл ДНҚ-ның әртүрлі бөлігіне немесе нүкте аймағына (сайттарға) белгілі өнімдер, мысалы белоктың спецификалы өзіндік қосылуын, транскрипцияның басталуы деп атаймыз. Сонымен гендердің экспрессиялы реттелуі дегеніміз қоршаған орта өзгерістеріне организмнің бейімделуі.

Эукариот гендеріндегі экспрессияның  реттелуі

Эукариот жасушасы үшін тән:

1. ДНҚ молекуласындағы экзондар мен интрондардың болуы.

2. мРНҚ пісіп жетілуі – бұл интрондарды қыю және экзондарды тігу.

3. Транскрипцияны реттейтін, реттеуші элементтердің болуы:

а) промоторлар - 3 түрі, әрқайсысына арнайы полимераза отырады.  

б) модуляторлар– транскрипция деңгейін жоғарылататын, ДНҚ бірізділіктері;

в) (энхансерлер) күшейтушілер– РНҚ синтезін бастайтын нүкте жағдайы және

 транскрипция деңгейін  күшейтетін бірізділіктер.

г) терминатор – трансляцияны және транскрипцияны тоқтататын ерекше тізбек.

д) сайленсер 100-200нуклеотидтен тұрады. Жоғары және төмен орналасуы мүмкін, ген экспрессиясын

тежейді.

е)Инсулятор-энхансердің қандай генге әсер ету керек екендігін бағыттап отырады.

РНҚ – полимеразалар бірнеше  суббөліктен тұратын, РНҚ катализдейтін  негізгі фермент. Бактериялар клеткасында  так қана бір РНҚ – полимераза барлық РНҚ – лардың түзілуін катализдейді. Эукариот клеткасында бұл қызметті үш түрлі РНҚ – полимеразалар: РНҚ – полимераза І, ІІ және ІІІ  атқарады.

РНК – полимераза І  негізінде ядрошықта орналасқан, рРНК гендерінің транскрипциясына жауапты. Ол РНК – лар 50 – 70  мөлшерінің синтезін қамтамасыз етеді, магний немесе марганец иондарымен активтенеді.

РНК – полимераза ІІ нуклеоплазмадатабылған. ОлмРНКізашарыгетерогенді РНК синтезінежауапты, оныңүлесінеклеткадатүзілетін РНК – лардың 20 – 40 тиеді. Магний иондарыменактивтенеді.

РНК – полимераза ІІІ нуклеоплазмадаорналасқан ,көптегенкіші РНК жәнетРНКсинтезінкатализдейді, клеткадағы РНК – ның 10 осыныңүлесінекеледі. Марганец иондарыменактивтенеді.

Транскрипция нүктесінің алдында геннің 5` - ұшына қарай (транскрипция бағытына қарсы) 23-30н.ж (орта есеппен 25 н.ж.) қашықтықта ТАТА – блок немесе Гольдберг – Хогнесс тізбегі  орналасады. ТАТА – блок ДНҚ тізбегін және транскрицияның инициация нүктесін РНҚ-полимераза ІІ ферменті жүйелі әрі  дұрыс тағдау үшін қажет.

 Бұл реттеуіш тізбек  промотордың басқа бөліктерімен  қатар транскрипцияның тиімділігін  де бақылайды. ТАТА-блоктың жоқ  болуы немесе оның өзгеруі  (нүктелік мутация) бақаның гистон  генінің транскрипциясының бес  есе кемуіне әкелетіні дәлелденеді.

 Одан әрі ТАТА-блоктың  алдында транскрипция бағытына  қарсы шамамен 75 н.ж (40-80 н.ж)  қашықтықта эукариоттық промотордың  тағы бір консервативті тізбегі  – ЦЦААТ-блогы орналасқан.

 Бұл блоктың қызметі  РНҚ-полимераза ферментінің промотормен  байланысуын өамтамасыз етеді  деп жорамалдануда. Бұл блок  тауықтың овальбумн және әр  түрлі глобин гендерінің транскрипциясының  тиімділігіне әсер етеді.

РНҚ полимераза промоторменқосылып ДНҚ шынжырынтарқатады. М-РНҚ біршынжырлы. ДНҚ –да РНҚ-ныңорналасуыкомплементарлықпринциппенөтеді. Мұндайбірізділіктрансляцияныңтерминациялы  кодоны депаталынады.

ДНҚ транскрипциялыаймағы, яғни промотор мен терминтаторарасындаорналасса транскрипция бірілігінемесетранскриптономдепаталынады. Алтүзілген РНҚ алғашқытранскриптатделінеді.

Прокариоттардаалғашқытранскриптатта РНҚ-ныңкөшірмесібірнешегендердентұрады, ал эукариоттарда – біреуғана.

РНҚ полимеразаныңбірнешетиптерібелгілі. РНҚ-ныңтранскриптаттың 5^/ - соңысинтезделінеді, соданкейінкэпирленеді. Кэпирлену – бұлбелгінуклеотидтердіңбірізділігініңқосылуы. Кэпирленуқызметі – РНҚ транскриптатаныбұзылуданқорғаужәнерибосомаменбайланысады. Одан трансляция басталады,сосынкэпалыныптасталынады.

Элонгация кезеңінемесе

 РНҚ –транскриптатыныңұзаруы

Бұлкезде ДНҚ тарқатылыпжәненуклеосомабұзылады. Синтез жылдамдылығы – секундына 30 нуклеотидтер. Элонгация – элонгациялыақуыздыфакторларменбақыланады.

РНҚ транскриптатсинтезіменбітеді. Стоп-кодонғатерминациялыақуызды фактор қосылады. Бұлкездетранскриптаттың 3^/ - соңына 100-200 аденилқышқылқалдықтарықлсылып поли А- құйрықтүзеді. Поли А – құйрық РНҚ транскриптаттыңдеградацияданқорғайдыжәнеоныңцитоплазмағатасымалдануынажеңілдікжасайды. Бірінші РНҚ транскриптатнуклеоплазмадасақталынуымүмкіннемесесплайсингкеұшырайды.

Бірінші РНҚ транскриптатбөліктергегетерогендіядролынуклеопротеиндібөлікқосылады, бұл процесс гя-РНП-бөлкдепаталынады.

Оларда РНҚ ұзындығы 5000 нуклеотидтергедейінжәнеақуыздыостькеоратылған. Гетерогенді РНП – бөліктеріэкзондар мен интрондарғақосылып, соданкейінжұптарыменбайланысыпагрегаттынемесесплайсосомтүзіледі. Сплайсосомқұрамына аз ядролы РНҚ кіреді. Қызметіинтрондардыүзу. Интрондардыңүзілуіжоғарыдәлділікпенжүреді. РНҚ сплайсингпроцессіндеспецификалы лассо-тәріздіқұрылымтүзіледі. Оларинтрондардыбосатыпэкзондардытігеді. Процессинг жәнесплайсинг РНҚ транскриптат: кэпирліқайталану, инициация кодоны – метионин, экзондар, стоп-кодон және поли Асоңынантұрады. Мұндай м-РНҚ цитоплазмағаөтіп, белоктың синтез процесінеқолданылады.

24.Трансгенді жануарлар алу әдісіне жалпы сипаттама.Осы заманғы биотехнологияның негізгі мақсаты-малдың генотипін жаңадан құрастырып, олардан адам үшін бағалы өнім өндіру. Мұны іске асыру үшін қажет генді иденфикациялау, бөлу және клонын алу, оларды зиготаларға ендіріп, экспрессиясын іске асырып ұрпаққа тұқым қуалауын шешу керек. Геномында бөтен ген немесе гендер бар жануарлар трансгенді (немесе трансформацияланған) деп аталады. Трансгенді жануарлар алу трансгеноз әдісі арқылы іске асады. Трансгеноз деп генді бір биологиялық жүйеден басқа жүйеге жаңа белгілері бар организмнің жаңа алу үшін жасанды жолмен тасымалдау түсіндіріледі. Трансгенді жануарлар әртүрлі биологиялық активті заттарды синтездеу және бағалы белгілері (тұқымдылығы және өсу қарқындылығы жоғары, вирустық ауруларға төзімді т.б.) бар малдардың жаңа тұқымдарын алу үшін қолданылуы мүмкін. Трансгеноз әдісімен бөтен генді эукариоттық жыныс жасушаға енгізіп, оның жұмысын бақылау арқылы гендік инженерияның кқптеген іргелі мәселелері шешіледі, өйткені мұнда трансгенді эмбрионның жатырдағы даму ерекшеліктерін зерттеу мүмкін болады. Бұдан басқа ген жұмысы механизмдердің түр ерекшелік дәрежесін айқындауға болады. Трансгенді жануарларды алу үшін рекомбинанттыгендерді микротүтікше және микрокапилярлар көмегімен ұрықтанған ооциттің (жұмыртқа жасушаның) пронуклеусіне енгізу әдісі кең қолданылады. Трансгеноз әдісі арқылы трансгенді тышқандар алу жақсы зерттелген. Мұның басты себебі тышқан ооциттері цитоплазмасының мөлдір болуы саналады. Басқа жануарлардың, соның ішінде малдың ооциттері мөлдір емес, сондықтан рекомбинантты ДНҚ-ны пронуклеуске енгізу өте күрделі және қиын әс. Осыған қарамай, соңғы кезде әртүрлі әдістемелік және техникалық жетілдірулер арқасында трансгенді қой, сиыр, шошқа және қоян алу іске асты.Трансгеноз жұмысы көп жақты бірнеше сатылардан тұрады. Алдымен, екі пронуклеус (аталық және аналық) сатысындағы зиготаларды алу керек. Бұл үшін синхронды овуляция, уақытылы қолдан ұрықтау немесе шағылыстыру керек, осыдан кейін белгілі уақыт өткеннен кейін зиготаларды хирургиялық жолмен алуға болады. Алынған зиготаларға бөтен ДНҚ-ны енгізбестен бұрын, оны in vitro жағдайында әртүрлі әдістер мен тәсілдер арқылы сақтау керек. Енгізу кезінде зиготалар вазелин майының астындағы арнайы ерітіндінің тамшысына орналасады, бұл сұйықтықтың кеуіп кетуінен сақтайды. ДНҚ-ны зиготаға енгізу үшін диаметрі 0,5-2 мкм аралығындағы шыныдан дайындалған микротүтікшелер қолданылады. Микротүтікшенің көмегімен 0,5 секундтан 2 минут аралығында ең аз дегенде онның минус он бір дәрежесі миллилитр ДНҚ-ны зиготаға микроскоптап бақылап енгізеді. Микроиньекциялау үдерісі зиготалар үшін зиянды, сондықтан олардың біраз мөлшері жойылып кетеді. Микроиньекциядан кейін 2 сағатқа жетпей жарамды зиготаларды (трансгенді) алдын ала, арнайы дайындалған аналық-рецепиенттерге тасымалдайды. Бұл кезеңдеде зиготалардың көп мөлшері зақымданады. Аяғында, трансгенді жануарлардың шығуы 1%тең болады. Алайда, мұның өзі трансформация және трансдукциямен салыстырғанда өте жоғары көрсеткіш болып саналады. Трансгенді малдарды алу зерттеулерінде тышқандардың трансгеноз әдісінің үлгісі икемделіп, қолданылады.

25 Ашытқы жүйесіндегі жасанды хромосомалар.ҮАС векторы. Ашытқы жүйесіндегі эписомалық вектолар.

Ашытқы жүйесіндегі эписомалық вектолар.Ашытқы ДНҚның негізінде бірнеше  векторлық молекулалардың типтері  құрастырылды. Оларды ДНҚ фрагменттерінің  алуан ұзындығын көбейту үшін пайдаланады. Осы вектордың бірі ашытқы жасанды хромосомасы (ҮАС). Табиғи хромосома сияқты жасанды жасалған хромосоманың әрбір соңында теломера, репликацияның бастауының учаскесі (ДНҚ синтездің бастапқы нуклеотид  тізбегі) ж/е центромера бар. Репликация бастаушы учаскесі(ori) деп аталады. Осы  компоненттер маркерлік гендерімен (TRP1ж/еURA3) ж/е рестрикциялық сайттардың кластерімен байланысады. Жасанды  хромосома мөлшері 230 мың жұп негізден 1900 жұп негізге түрлендіреді.Осы  себептен ашытқы жасанды хромосомада  мөлшерлері100 мың жұп негізден 1000 жұп негізден ДНҚның фрагменттерін  көбейту мүмкін.Сондықтан векторларда  әртүрлі лрганизмдердің геномдарын, оның ішінде адамның геномын зерттеу  үшін мүмкіндік береді.

26 Ашытқы жуйесі. 2 мкм плазмидасы негізіндегі экспрессияланушы векторлар (интеграцияланушы векторлар).

Эукариоттар ген инженериясында қарапайым эукариот - ашытқының елеулі маңызы бар. Ашытқылар бір клеткалы болғанымен оларда эукариоттарды сипаттайтын  барлық қасиеттер бар:цитоплазмадан  ядро қабығы  арқылы оқшауланған  ядросы бар және ДНҚ – ның репликация, транскрипция және трансляциясының  ферменттік аппараты  (оның ішінде сплайсинг  ферменттері ) басқа эукариоттардағыдай.Ашытқылармен генетикалық жұмыс жүргізу өте  жеңіл:бактериялар сияқты сұйық  ортада өсе алады,қатты ортада шоғыр  түзеді, тіпті парафин, метил спирті сияқты субстраттарда да тез көбейе алады.Бұдан басқа ашытқылар геномының  мөлшері үлкен емес – 1.7·107н.ж.Ең бастысы ашытқылар генетикалық  тұрғыдан жақсы зерттелген.

    Ген инженериясында  ашытқылар ішінен Saccharomyces cerevisiae штамы  ең көп қолданылады.

Себептері:

1.Өте қолайлы, эукариотқа  тән белгілері бар.

2.Генетикасы, физиологиясы  жақсы зерттелген 

    650 гендерінің орындалатындығы  анықталған

    17 хромосома, геномы  толығымен синквистелген 

3. Барлық посттрансляциялық  модификацияларының түрлері бар

4. Қауіпсіз организмдер  тізіміне жатады.

5. Экспрессияға қажет промоторлар  табылған.

    Қос гибридті  ашытқы жүйесі – белгілі ақуыздардың  сәйкес келуін анықтап қана  қоймайтын, сонымен қатар ашытқы  клеткаларын пайдалана отырып in vivo жаңа сәйкес келетін ақуыздарды  табатын әдіс болып табылады.