Шпаргалка по "Генной инженерии"

Қос гибридті ашытқы жүйесінің  элементтері:

 

- ДНҚ байланыстырушы домен ретінде қолданады:

1. Gal4 ақуызының домені DB;

2. LexA бактериальдық ақуыз.

- ДНҚ спецификалық сайтымен байланыстырушы екі ақуызды да димер түрінде;

- Активтейтін домендерді де қолданады:

1. Gal4 ақуызының мықты АD-сы;

2. Р16 герпес вирусының ақуызы өте мықты  АD-сы;

3. Әлсіз бактериальдық AD B427.

Қос гибридті ашытқы жүйесінде  қолданатын репортерлі гендер:

1. lacZ – ақуыздардың сәйкес  келуін сандық баға беру үшін  қолданылады.

2. HIS3 (LEU2) – аминқышқылдық  синтез үшін қажет гендер. Негізі  олар ашытқы геномында интеграцияланған.

Қос гибридті ашытқы жүйесінің  моделі:

Бір гибридті ашытқы жүйесінің  моделі:

 

а) Х ақуызыменкезектегі ДНҚ  У танып репортер генінің транскрипциясы активтенеді.

б) Кері бір гибридті система.

Бір гибридті ашықты жүйесі

 

 

- Компетентті келткаларды дайындау;

- Интеграция үшін сызықтандырылған векторлармен трансформациялау;

- Рекомбинанттарды His ортасында сұрыптау;

- Өскен колонияларды белгілеу;

- His-3 репортерлі штаммы үшін 3-АТ-ның қолайлы концентрациясын анықтау;

- lacZ репортерлі плазмидасын HIS3 репортерлі штаммына интеграциялау;

- [HIS3, lacZ] AD ақуызымен қосылған репортерлі штаммын /–His/–Leu/ + 3-AT/ минималды ортада сұрыптау;

- Өскен колонияларға бета-галактозидазалық белсенділігін тестілеу;

- His+ , LacZ+ клондары экпрессия кандидаттары болып табылады.

 

Ашытқы жүйесіндегі векторлар:

1. Yіp интеграцияланушы векторлар;

2. Yep эписомдық векторлар;

3. YRp репликацияланушы векторлар;

4. YCp центромерлі векторлар;

5. YAC жасанды хромосомалар.

Селективті маркерлер:

URA3, LEU2, TRP1, HIS3

Интеграцияланушы векторлар

    Ori ауданы болмайды  және өздері репликациялана алмайды.  Хромосомаға интеграцияланады. Ашытқыларда  гомологиялық рекомбинация өте  жақсы жүреді, сондықтан да интеграция  жүру үшін гомология аудандары  қажет.

Ашытқы жүйесіндегі жасанды  хромосомалар

Ашытқы жүйесіндегі хромосомалар ДНҚ-ның үлкен фрагменттерін тасмалдауғақабілетті,бірақ  оның эффективтілігінің өзгеруі  өте төмен.

YAC векторының негізгі  компоненттері:

- Centromers (CEN), телмерлер(TEL);

- Селективті күшейту және маркерлер үшін күшейткіштер, клетка идентификациясы үшін TRP1 и URA3 сияқты.

- Рестрикция ферменттерінің сайтын тану.

Және онда ARS бар. Вектор бактерияда көбейеді, себебі, векторда көбеюге  қажетті Ori ауданы және ампициллинге тұрақтылық бар.

Эписомдық плазмидалар

2 мкм ашытқы плазмидасы  ашытқылардың көп көшірмелі циклді  плазмидалары. Репликация генін  (REP1, REP2), сайт спецификалық рекомбиназаны  (FLP)  кодтайды, амплификация локусынан  (D)  және плазмиданың бөлінуіне  жауапты локустардан (STB) тұрады. Плазмиданың өзі екі сайттан  тұрады.

Эписомды плазмиданың  негізінде шатл-векторлар жасалады. Ori ауданы, селективті марекерлер, промотордан  тұрады.

27.Өсімдіктерді агробактериялар арқылы трансформациялау.Трансгенді өсімдіктер.

Агробактерия деген топырақта  мекендейтін бактериялар тобы.Гендік  инженерия әдісі көмегімен бактериялардың геномына жаңа гендерді плазмида арқылы яғни сақина тәрізді біртізбекті  ДНк арқылы енгізуге болады.Будандық плазмидаларды , яғни .құрамында бізге  қажетті  генмен болатын плазмидаларды, E.coli дақылдарына қосады. Бактерияларда  плазмида сіңіп ген ретінде қызмет етеді, сонымен қатар плазмида сіңіп  ген ретінде қызмет етеді, сонымен  қатар плазмида бактериялық жасушаларда  көбейіп, жаңа аққуыздың синтезін қамтамасыз етеді. Одан кейінрекомбинанттық ДНҚ  өсімдіктердің тірі жасушасына енгізіледі. Жаңа генннің экспрессиясы өтеді  де, жасуша бөтен ген белгілейтін  аққуызды синтездей бастайды. Вектор ретінде гробактерия плазмидалар, хлоропластық және митохондриялық ДНҚ, жылжымалы генетикалық элементтер, вирустар қолданылады.

   Ti- плазмида – бұл  Agrobacteria tumefaciens  топырақты бактерияның  плазмидасы және өсімдіктердің  ісік ауруын қоздыратын агент  болып табылады.  Бұл бактерия  өсімдіктің жарақаттанған ұлпасы  арқылы жасушаға кіргенде өзінің  гендерін бірге ала келіп, өсімдік  геномына енгізеді. Соның салдарынан  өсімдікті жңа аққуыздарды синтездеуге  мәжбүр еткізеді.  Нәтижесінде  бактериягендерін қабылдаған өсімдік  жасушалары өте тез көбейіп,  тамыр мойынында ісік, бұлтық  пайда болады.  Бұл инфекция  үдерісі  шын мәнісінде табиғи  гендік инженерия. Ісік жасушаларында  сау жасушаларда болмайтын опиндер деген жаңа классқа жататын химиялық заттар табылды. Опиндер-ол аргинин амин қышқылының туындылары. Жақсы зерттелгендер: октопин- аргинин мен пирожүзім органикалық қышқылының туындысы, нопалин- аргинин мен a кетоглутараттың туындысы.Ауру туғызған бактерияның штамына байланысты ісік жасушалары октопинді немесе нопалинді ситездейді.Және виргендер – оң иық немесе сол иық ауданын қиюшы.ТДНҚ-ға кіруіне қамтамасыз етеді.Ішек таяқшасына қажетті ori ауданы болады. Уникальді рестрикциялық сайд болу қажет. Маркерлі гендер болу керек, L және R иықтар, өсімдік жүйесінде қарқынды эксрессиялау үшін промотор мен терминатор болу керек. Осы шарттар болса ғана  Ti плазмида жұмысын атқарады.

A.tumefaciens арқылы өсімдіктерге  ісік ауруын жұқтырып,оларды трансформациялау  үшін бүтін Ті-плазмида емес,оның  екі бөлшегі жеткілікті.1ші Т-Днқ  екі жағындағы тек шекаралық  бөліктері басқасы Ті-плазмиданың  вир-бөлігі,бұл бөліктер бір плазмиданың  құрамында ғанаемес,ір  түрлі  плазмидаларда болуы мүмкін.Егер  агробактериялардың бір плазмидасында  вир-бөлігі болса,ол екіншісінде  Т-ДНҚ бөлігі болса,олар өсімдік  клеткаларын трансформациялауға  қабілетті.Сонымен Т-ДНҚ-ның құрамында  қандай да бөтен ген ендәрәлсе  де,ол өсімдік геномына тіркесе  алады.

28.Ті-плазмидасы сипаттамасы .мутанттары.

Ti- плазмида – бұл Agrobacteria tumefaciens  топырақты бактерияның  плазмидасы және өсімдіктердің  ісік ауруын қоздыратын агент  болып табылады.  Бұл бактерия  өсімдіктің жарақаттанған ұлпасы  арқылы жасушаға кіргенде өзінің  гендерін бірге ала келіп, өсімдік  геномына енгізеді. Соның салдарынан  өсімдікті жңа аққуыздарды синтездеуге  мәжбүр еткізеді.  Нәтижесінде  бактериягендерін қабылдаған өсімдік  жасушалары өте тез көбейіп,  тамыр мойынында ісік, бұлтық  пайда болады.  Бұл инфекция  үдерісі  шын мәнісінде табиғи  гендік инженерия. Ісік жасушаларында  сау жасушаларда болмайтын опиндер  деген жаңа классқа жататын  химиялық заттар табылды. Опиндер-ол  аргинин амин қышқылының туындылары. Жақсы зерттелгендер: октопин-

аргинин мен пирожүзім  органикалық қышқылының туындысы, нопалин- аргинин мен a кетоглутараттың туындысы.Ауру туғызған бактерияның штамына байланысты ісік жасушалары октопинді немесе нопалинді  ситездейді.Және виргендер – оң иық немесе сол иық ауданын  қиюшы.ТДНҚ-ға кіруіне қамтамасыз етеді.Ішек таяқшасына қажетті ori ауданы болады. Уникальді  рестрикциялық сайд болу қажет. Маркерлі гендер болу керек, L және R иықтар, өсімдік  жүйесінде қарқынды эксрессиялау үшін промотор мен терминатор болу керек. Осы шарттар болса ғана  Ti плазмида жұмысын атқарады.

Америка гентиктері 1977 жылы анықтаған тәж тәрізді ісіктер  өсімдік хромосомасының құрамына Ті-плазмиданың  белгілі бір бөлігінң кіруі арқасында  пайда болады.Бұл фрагмент т-Днқ  деп атайды.Мутанттар мен өткізілген генетикалық зерттеулері Ті-плазмиданың т-ДНҚ фрагменті ғана ісіктің пайда болуына опиндер синтезіне тежелуіне жауапты.Ісік тудыратын мутант октопин түзгіш плазмида алынған.Мысалы тамыр мен өркеннің өсуіне себепкер болады.

29.Ті-плазмидасы негізіндегі  векторлар

Ті –плазмида және оның сипаттамасы

Гендік  инженерия әдісі  көмегімен бактериялардың геномына жаңа гендерді плазмида арқылы яғни сақина тәрізді біртізбекті ДНк арқылы енгізуге болады.Будандық плазмидаларды , яғни .құрамында бізге қажетті  генмен болатын плазмидаларды, E.coli дақылдарына қосады. Бактерияларда плазмида сіңіп ген ретінде қызмет етеді, сонымен қатар плазмида сіңіп  ген ретінде қызмет етеді, сонымен қатар плазмида бактериялық жасушаларда көбейіп, жаңа аққуыздың синтезін қамтамасыз етеді. Одан кейінрекомбинанттық ДНҚ  өсімдіктердің тірі жасушасына енгізіледі. Жаңа генннің экспрессиясы өтеді де, жасуша бөтен ген белгілейтін аққуызды синтездей бастайды. Вектор ретінде гробактерия плазмидалар, хлоропластық және митохондриялық ДНҚ, жылжымалы генетикалық элементтер, вирустар қолданылады.

   Ti- плазмида – бұл  Agrobacteria tumefaciens  топырақты бактерияның  плазмидасы және өсімдіктердің  ісік ауруын қоздыратын агент  болып табылады.  Бұл бактерия  өсімдіктің жарақаттанған ұлпасы  арқылы жасушаға кіргенде өзінің  гендерін бірге ала келіп, өсімдік  геномына енгізеді. Соның салдарынан  өсімдікті жңа аққуыздарды синтездеуге  мәжбүр еткізеді.  Нәтижесінде  бактериягендерін қабылдаған өсімдік  жасушалары өте тез көбейіп,  тамыр мойынында ісік, бұлтық  пайда болады.  Бұл инфекция  үдерісі  шын мәнісінде табиғи  гендік инженерия. Ісік жасушаларында  сау жасушаларда болмайтын опиндер  деген жаңа классқа жататын  химиялық заттар табылды. Опиндер-ол  аргинин амин қышқылының туындылары. Жақсы зерттелгендер: октопин-  аргинин мен пирожүзім органикалық  қышқылының туындысы, нопалин- аргинин  мен a кетоглутараттың туындысы.Ауру  туғызған бактерияның штамына  байланысты ісік жасушалары октопинді  немесе нопалинді ситездейді.Және  виргендер – оң иық немесе  сол иық ауданын қиюшы.ТДНҚ-ға  кіруіне қамтамасыз етеді.Ішек  таяқшасына қажетті ori ауданы  болады. Уникальді рестрикциялық  сайд болу қажет. Маркерлі гендер  болу керек, L және R иықтар, өсімдік  жүйесінде қарқынды эксрессиялау  үшін промотор мен терминатор  болу керек. Осы шарттар болса  ғана  Ti плазмида жұмысын атқарады.

30.Рекомбинантты ДНҚ  технологиясының практикада қолданылуы. Гендерді өндірістік деңгейде  клондау.

Қазіргі кезде тек ген  инженериясы  ғана адамға қажетті  биологиялық активті заттарды химиялық таза күйде алуды қамтамасыз ете  алады. Ген инженериясының қарқынды дамуы арқасында адамның бірқатар ауруларын (оның ішінде генетикалық  ауруларды) емдеу және ауыл шаруашылық малдарының өнімділігін жоғарылату мүмкін болды. Енді, олардың мысалдарына  тоқталайық.

Алғаш рет  медицинада ген  ннженериясының өнімі —инсулин қолданды. Инсулин ұйқы безінде түзіледі, оның арқасында қандағы глюкозаның артық мөлшері жануар текті крахмал гликогенге айналады. Ұйқы безінде инсулиннің түзілуі бұзылатын болса, адам диабет ауруына ұшырайды: глюкоза гликоген түрінде бөгеліп  қалмағандықтан, қанда жүзім қантының мөлшері артады. Есептеу бойынша дүние жүзінде 60 млн. адам диабетпен ауырады, яғни ол жүрек және рак ауруларынан кейін адамның өліміне әкелетін үшінші ауру болып саналады. Диабетпен ауыратын адам тәулігіне гормонның орта есеппен 40 бірлігін қабылдауы қажет. Осы уақытқа дейін инсулиннің негізгі шығу көзі — етке өткізілген сиыр мен шошқаның  ұйқы безі болатын. Сиырдың ұйқы безінің салмағы 200—500 г; кристалдық инсулиннің 100 г. алу үшін 800—1000 кг. ұйқы безі қажет. Бұдан басқа, ауру адамдардың біраз бөлігі, әсіресе балаларда бұл гормонға аллергия дамығандықтан, оларды жануар текті гормонмен емдеудің қиындығы бар. Екінші жағынан, инсулинге тәуелді адамдардың саны жылдан жылға арта түсуде. Осы себептерге орай адамның ген-инженерлік инсулинін бактерия клеткасында өндіру қажеттігі туды.

Инсулин гормонының ұзындығы 20 және 30 амин қышқылдарына тең А және В екі полипептидтік тізбектен құралған, олар бір-бірімен қос дисульфидтік байланыс құрады. Организмде инсулин алғашқы кезде 109 амин қышқылдарынан құралған препроинсулин құрамына енеді. Препроинсулиннің ұйқы  безі — клеткаларында синтезделуінде алғашқы 23 амин қышқылы молекуласының клетка мембранасынан өту үшін қажет болады; бұл амин қышқылдар ажырап, 86 амин қышқылдарынан тұратын проинсулин түзіледі. ІІроинсулиннің орта бөлігі ферменттің әсер етуімен ыдырап кетеді, мұның нәтижесінде инсулин түзіледі.

Адам инсулин генін  алғаш рет 1978 ж. «Генентек» фирмасы (АҚШ) синтездей алды. Соматостатин гені сияқты инсулиннің синтетикалық, гені плазмидаға — галактозидаза генімен, соңына енгізілді. Мұнда әрбір бактериялық клеткада инсулиннің шамамен 100 000 молекуласы синтезделді. Е.СоІі клеткасында проинсулиннің биосинтезі іске асты; ол үшін кері транскриптазаның көмегімен РНҚ-дан оның ДНҚ-көшірмесі (кДНҚ) синтезделді. Америкалық «Эли Лилли» фирмасының зерттеушілері Е. СоІі клеткасының 20% көлемін проинсулин немесе инсулин  алатынын атап көрсетті. Көлемі 1000 л бактерия культурасынан 200 г дейін инсулин өндіруге болады, әншейінде гормонның мұндай мөлшерін өндіру үшін сиырдың немесе шошқаның 1600 кг ұйқы безін өңдеу қажет болар еді. 1982 жылы АҚШ-тың азық-түлік өнімдері, косметикалық заттар, дәрі-дәрмектер Федералдың Басқармасы (FDА) «Эли Лилли» компаниясы шығаратын «Хемулин» (инсулиннің саудалық аталуы) препаратын сатуға рұқсат берді. Ұлыбритания мен СССР-де рДНҚ технологиясы арқылы бактерия клеткасында инсулин өндіру 1980 жылдары ойдағыдай шешілді.