Шпаргалка по "Генной инженерии"

Алғаш рет ДНҚ полимераза 1958 жылы Е.соli-дан Корнберг бөліп алды. ДНҚ-полимераза 1 E.coli (Pol 1) сақиналы қос тізбекті ДНҚ-мен байланыспайды. Бірақ, осындай молекулаларды денатурациялап,бір тізбекті формасын алсақ,соңғысымен полимераза саны бойынша байланысады. Мысалға, 1 молекула 300 нуклеотид қалдығына тең.Pol 1 бір тізбекті қос спиральді ДНҚ учаскелерімен байланысады,3-гидроксил және 5-фосфат соңымен және қос тізбектіті ДНҚ молекуласымен байланысады. Фермент мономерлі полипептидтік тізбектен тұрады. Mr=103кДа және 3 доменді құрылымнан тұрады. Әр домен өзіндік ферментативтік активтілікке ие:1. 5-3–полимеразды; 2. 3-5-экзонуклеазды; 3. 5-3-экзонуклеазды; 1) 5-3-полимеразды активтілік. Реакция үшін бір тізбекті мат-қ ДНҚ және осы тізбекке комплементарлы фрагмент болуы керек. Праймер 3-ОН соңды болу керек. 2) 3-5-экзонуклеазалық активтілік. 3-ОН-соңды бір және екі тізбекті ДНҚ-ны гидролиздейді. 3-5-нуклеаза ДНҚ-ның жұптаспаған учаскелеріндегі диэфирлік байланысты ыдыратады. Полимераздық реакция кезінде белгілі комплементар емес нуклеотид қосылады. Бірақ полимераза нуклеотидті дұрыс емес жұптасқан тізбекке жалғай алмайды. Ол тізбек полимераза қатысуымен болады. Көмекке 3-5 экзонуклеаза келеді. Ол қате нуклеотидті алып,орнына дұрыс нуклеотид жалғанады. 3-5 экзонуклеазалық активтілік ДНҚ-ның кері синтезі кезінде шығады. Осылайша,3-5 экзонуклеазалық активтілік полимеризация дәлдігінде маңызды. 3) 5-3 экзонуклеазалық активтілік. Қос тізбекті ДНҚ-ның бір тізбегін 5-бос соңынан бастап деградирлейді. 3-5 экзонуклеазаға қарағанда қос тізбекті ДНҚ молекуласының жұптаспаған участоктарындағы диэфирлік байланысты ыдыратады. 3-5 нуклеаза ол уақытта тек бір ғана,нуклеотидттерге бөледі. 5-3 нуклеаза 5- соңынан бастап ұзындығы ондаған қалыңдықтан тұратын олигонуклеотидтерді үзе алады. N- соңғы домен көрші петлямен байланысқан. Ол аминқышқыл қалдықтарынан тұрады және протеопитикалық ферменттер арқылы оңай ажыратылады. Қалған бөлігі бифункционалды. Себебі, полимеразадан және 3-5- экзонуклеазадан тұрады. Ол Кленов фрагменті деп аталады. Ол фрагмент қос тізбекті ДНҚ-ның бір тізбегіндегі 5- соңынан салынып бітуіне пайдаланылады және бір тізбекті ДНҚ-ң екінші тізбегінің синтезіне, қос тізбекті ДНҚ молекуласының 3- соңды бір тізбекті ДНҚ молекуласының гидролизі үшін. Poli –А-полимеразаны E.coli 1973 жылы Сиппел ашты. Ол 3-ОН соңды қостізбекті РНҚ-молекуласына Poli (А) тізбегінің қосылуын катализдейді. РНҚ молекуласының комплементарлы ДНҚ-ға көшірілуіне дайындауда 3-соңын РНҚ-ның радиоактивті белгілеу үшін қолданады.Ктерияларда бес ДНК-полимераза анықталған:

ДНК-полимераза I  ДНК қалпына келтіруге қатысады, 5'-3', және 3'-5'-экзонуклеазды қасиетке ие;

ДНК-полимераза II зақымданған ДНҚ репликациясына қатысады. 5'-3' тізбегінің ұзаруына қатысады және 3'-5'-экзонуклеазды қасиеті бар;

ДНК-полимераза III — бактериялардың негізгі полимеразасы, 3'-5'-экзонуклеазды қасиеті бар;

ДНК-полимераза IV, Y тобындағы ДНК-полимераза;

ДНК-полимераза V, Y тобындағы ДНК-полимераза, ДНҚның зақымданған учаскесін өткізіп жіберуге қатысады.

Эукариоттық ДНК-полимеразалар:

Эукариоттарда кем дегенде ДНК-полимеразаның он бес түрі бар:

ДНК-полимераза α ДНҚ праймерін синтездей отырып, праймаза ретінде шығады, кейін қалыпты полимераза ретінде, сол праймерге нуклеотидтерді байланыстырады. Тізбектің ұзындығы жиырма нуклеотидке жеткен кезде транскрипцияға полимераза δ және ε кіріседі;

ДНК-полимераза β ДНҚ қалпына келтіруге қатысады;

Pol γ, митохондриялы ДНҚ репликациясына қатысады;

ДНК-полимераза δ —  эукариоттардың негізгі полимеразасы.  3'-5'-экзонуклеазды қасиетке ие;

ДНК-полимераза ε, кейде 3’-5’- моноспиралінің синтезі кезінде ДНК-полимеразу δ алмастырады. Полимеразаның негізгі қызметі анық емес;

Y тобынадғы  ДНК-полимеразалар η, ι, κ, и Rev1.бұл полимеразалар ДНҚ зақымданған ауданын тастап кетіге қатысады.

Сонымен қатар али толық  зерттелмеген эукариоттық ДНҚ полимеразалар  бар: θ, λ, φ, σ и μ.

8. ДНҚ тізбегін анықтаудың химиялық әдісі (Максам-Гильберт).

Ген инженериясының соңғы  этапында алынған ДНҚ үзіндісінің  нуклеотидтер қатарын анықтау керек. Көп жылдар бойы бұл проблеманы шешу үшін ғалымдар әр түрлі әдістерді  қолданды, алайда оның ешқайсысы ойдағыдай  болмады. Ақырында ген инженериясы  әдістерінің дамуымен бұл проблема 1977 ж. таза химиялық әдіс арқылы шешімін  тапты. Қазіргі кезде ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер қатарын анықтау үшін екі әдіс — Максам-Гилберт және Сэнгер-кең қолданылады. Екі әдістің  де мәні мөлшері бойынша бір негізге  айырмашылығы бар жалғыз тізбекті ДНҚ  молекуласын алудан тұрады. Мұндай молекулаларды электрофорез көмегімен  акриламид гелінде бөлуге болады. Мөлшері әр түрлі белдеулер ұзындығы 300 нуклеотидке дейін жететін  «саты» түзейді.Бірінші әдісті АҚШ  ғалымдары У. Гилберт пен оның шәкірті Л. Максам ұсынды. Мұнда қостізбекті  ДНҚ үзіндісінің 5'— ұштарын радиоактивті фосформен белгілейді. Мұны ішек таяқшасын  зақымдайтын, Т4 бактериофагынан бөлінген полинуклеотидкиназа іске асырады. Бұл фермент АТФ молекуласынан  фосфат тобын ажыратып, полинуклеотидтің 5'— ұшына жалғайды. Бұдан кейін  қос тізбекті ДНҚ-ны денатурациялап, ДНҚ-ның жеке тізбектерін гелде  электрофорез арқылы айырады. Мұнан  соң тізбектің әрқайсысын гелден жеке жуып алып, бөлек зерттейді. Ары  қарай, үлгілерді төрт бөлікке бөледі. Біріншісіне ДНҚ-ны кез келген аденинді нуклеотидінен кейін үзетін ерітінді қосады. Оны ДНҚ тізбегінің бір  аденин бөлігін ғана үзетіндей етіп қосу керек. Нәтижесінде тізбекте адениннің  әр қилы орналасуына байланысты ұзындығы әр түрлі ДНҚ үзінділері пайда  болады. Дәл осындай жолмен басқа  үш бөлікті де ДНҚ-ны тиминнен, гуаниннен  және цитозиннен кейін үзетін реагенттермен  өңдейді. Барлық төрт үлгідегі ДНҚ үзінділері бір-біріне параллель орналасып, полиакриламид  гелінде электрофорез арқылы айырады: молекуласы аз кесінділер жоғары молекулалы кесінділерге карағанда гельде жылдам қозғалады.Мұнда қолданылатып электрофорез әдісі жақсы жетілген, ол барлық ДНҚ фрагментерін ұзындығы бойынша  жеке бөліктерге айыруға мүмкіндік  береді. Қазіргі кезде ұзындығы 300-ге дейін ДНҚ тізбегінің нуклеотидтер катарын анықтаудың ешқандай қиындығы жоқ. Геннің нуклеотидтер қатарын оқу  үшін қараңғыда гелдің үстіне рентген  фотопленкасын беттестіреді, мұнда  радаоактивті таңба бар орындар  ғана таңбаланады. Фотопленкада 5/ - ұштары белгіленген ДНҚ кесінділері  ғана көрінеді, ал олардың гелдің басынан  жылжыған ара қашықтығы кесіндінің ұзындығына дәлме-дәл келеді. Енді ДНҚ  тізбегін төменнен жоғары қарай оқып, геннің нуклеотидтік қатарын анықтауға  болады.Зерттеуші екінші комплементарды ДНҚ үзіндісінің нуклеотидтер қатарын  анықтап, бірінші тізбектен алынған  мәлімет дұрыстығын тексере алады. Мұнда тек, бірінші тізбектегі аденин мен цитозиннің орнына екінші тізбекте тимин мен гуаниннің сәйкес келетінін  естен шығармау керек.

Қысқаша МАКСАМ-ГИЛБЕРТ әдісінің этаптары:

1-этап: Әр түрлі химиялық  агенттер  әсерінен  белгілі шамадағы нуклеотидттерді   моификациялау;

2-этап  модификацияланған негіздерді және 2 фосфаттың В-элименациясын жоғалту  (дезоксирибозаны қоршаған)

Сосын 4 түрлі реакция нәтижесінде олигонуклеотидті  молекулалардың қосындалары пайда  болады,олар мөлшері және радиоактивті таңбалануы бойынша ажыратылады. Радиоактивті таңбаланған молекулалардан басқа да олигонуклеотидті фрагменттер болады бірақ радиоавтография этапында оларды көру мүмкіншілігі жоқ.Радиоавтография этапынан кейін рентген пленкасында ДНҚ сызықтарынан құралған «баспалдақты » көруге болады. Оны «оқу» секверленіп отырған ДНҚ фрагменттерінің нуклеотид тізбектерін анықтауға мүмкіндік береді.

9. ДНҚ кесінділерін М13 бактериофагында клондау және сиквинс әдісі (Сэнгер әдісі).

ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарын  анықтаудың екінші тәсілін Нобель сыйлығының екі дүркін лауреаты атанған ағылшынның атақты ғалымы Ф. Сэнгер ұсынды. Сэнгер әдісінің көп жақтары Максам-Гильберт әдісімен ұқсас болғанымен оның принципінің  айырмашылығы бар — Сэнгер бойынша  нуклеотидтер қатарын анықтау ДНҚ-полимераза яғни ДНҚ-ны ажырататын емес, керісінше  оны синтездейтін фермент көмегімен  іске асады. Мұнда ген үзіндісінің  өзі емес, ДНҚ-полимеразаның көмегімен  синтезделетін ДНҚ молекуласы зерттеледі. Ферменттің әсерімен ұзындығы әр түрлі  ДНҚ молекулалары синтезделеді, олардың 5'— ұштары бірдей, ал 3'— ұштары төрт азоттық негіздің (А, Т, Г немесе Ц) бірі бойынша әр түрлі.

Секвенстеуге керек элементтер:

-секвенирлеуші праймер  (ДНҚ молекуласының белгілі бір  аймағына комплементарлы жасанды  синтнзделген олигонуклеотидті  тізбек) -праймер-секвенстеуді қажет ететін, бастапқы аймаққа комплементарлы кішігірім бір тізбекті ДНҚ молекуласы. ДНҚ-полимеразалар синтезді бос кез-келген аймақтан бастамас үшін праймер керек.

• -4 дезоксинуклеотидтерден dATP, dCTP, dGTP, dTTP жинақталған 4 пробирка;
• -ДНҚ полимераза

 Сэнгер әдісінде нуклеотидтер  қатары белгісіз ДНҚ сегментін  М1З бактериофагының ДНҚ-сынан  құрастырылған арнайы векторға  енгізеді. Біз бұл фагтың векторлық  молекула ретінде ыңғайлы айырмашылығын  жоғарыда қарадық, атап айтқанда  генді жалғыз тізбекті күйде  тасымалдай алады. Мұндай тізбектің  нуклеотидтер қатарын анықтау  оңай. М1З бактериофагының ДНҚ-сы  қос тізбекті күйде де бола  алады. Осындай фагтың негізінде  бірнеше векторлар құрастырылды. Фагтың репликациясы үшін оның  геномының маңызды емес аймағына  шамамен ондаған әр түрлі рестриктазалар  үзе алатын полилинкер жалғанады.  Полилинкердің қатарына 17 н. ж.  құралған тізбек жалғанады. Осындай  векторды рестриктазалардың бірімен  үзгеннен кейін оны талдауға  алынған және сол рестриктазамен  үзілген ДНҚ бөлігімен біріктіреді.  Мұнда ол вектордың 17 мүшелік  тізбегімен қатар орналасады. Міне  осындай рекомбинантты ДНҚ-ны  бактерия клеткасына енгізіп,  одан жалғыз тізбекті ДНҚ-сы  бар фагтарды алады. Енді фагтан  ДНҚ-ны айырьш, оны талдауға кірісуге  болады.

2.Сэнгер әдісі «тізбекті  үзу» әдісі деп аталады. Яғни  ДНҚ-полимераза арқылы түзілетін  комплементарлы ДНҚ-ның синтезі  Максам-Гилберт әдісіне сәйкес  әрбәр негізде тоқтайды. (үзіледі).Ал, ДНҚ-полимераза үшін ашытқы (праймер)  керек, ол үші фектордың 17-мүшелік  тізбегіне комплементарлы олигонуклеотид  синтезделеді.

 Егер олигонуклеотид-ашытқыны  матрицалық ДНҚ-мен байланыстырып,  ДНҚ-полимераза мен дезоксинуклеозид-трифосфаттарды  қосса, онда ДНҚ бөлігінің толық  көшірмесін ала аламыз. Мұнда  әрбір келесі азоттық негіз  өсіп жатқан тізбектің 3'— ұшының гидроксил тобына жалғанатынына мән беру керек. Сэнгер әдісі үшін ДНҚ бөлігінің толық көшірмесі емес, оның үзінділері қажет.

 Матрица-ашытқы комплексін  төрт бөлікке бөледі де, олардың  әрқайсысына тізбектің 3'— ұштары  азоттық негіздерінің аналогтары  — дидезоксинуклеозидтрифосфаттарды (ddNТФ) қосады. Мұндай дидезоксинуклеозидтердің  рибоза қалдығының көміртегі  атомдарында гидроксил тобы болмайды, сондықтан өсіп жатқан 3'— ұшының  синтезін белгілі негізден кейін  тоқтайды. Мысалы, тимидинмен аяқталатын  ДНҚ фрагменттерін алу үшін  ортаға дидезокситимидинтрифосфатты,  тізбекті аденозин бойынша үзу  үшін дидезоксиаденозинтрифосфатты  және т.с.с. қосады. Әрине, төрт  бөліктің әрқайсысына қалыпты  дезоксинуклеозидтрифосфаттардың  бірін (dТТФ, dАТФ, (dЦТФ және dГТФ)  қосу керек. Нәтижесінде ұзындығы  әр түрлі, бірақ 3'— ұштары  бірдей олиго — және полинуклеотидтер  жиынтығын алады. Олардың электрофореграммасын  радиоаутография әдісі арқылы  оқып, геннің нуклеотидтер қатарын  анықтайды.

 Максам-Гилберт және  Сэнгер әдістеріе қолданып, РНҚ  тізбегінің нуклеотидтер қатарын  да анықтауға болады. Бұл әдістердің  осы заманғы молекулалық биология  мен гепетика үшін маңызы зор.  Оларды пайдалану арқасында қазіргі  кезде көптеген вирустар, бактериялар  және олардың плазмидалық элементтері  геномдарының алғашқы құрылымы  анықталды. Нуклеотидтері белгілі  гендердің ұзындығы 6 млн. асьш  кетті. Қазіргі кезде кейбір  митохондрия мен хлоропластардың  ДНҚ құрылымы толық белгілі  болды, олардың ДНҚ молекуласының  ұзындығы 150 н. ж. асып түсті.

Бұдан да ұзын тізбектерді  оқу үшін Сэнгер әдісінің әртүрлі  модификациялары бар. Ол әдістер  алды ала E.coli-дегі  М13 фагына негізделіп құралған векторларда ДНҚ-ның клондауына негізделген. Олар денатурация мен  праймерсіз синтезделе алады. E.coli M13 фагының  ерекшелігі-2 формада тіршілік ете  алуы: 1-плазмида сияқты функционерленген қос тізбекті репликативті; 2- секвенирлеуге  матрица ретінде қолданылатын біртізбекті  фагтық.

Өте ұзын ДНҚ фрагменттерін (шамамен 2000 ж.н ) секвенстеу үшін бұдан  күрделі комбинирленген жолдар қолданылады. Соның бірі берілген фрагментті плазмидтік векторда клондау және оның рестрикционды  картасының жасалуына негізделген.

Көп жылдарға деін Сенгер әдісінің жақсарған түрі геномдарды  көптеген түрде секвенстеудің  негізгі  әдісі болып келеді және толық  геномдардың көптеген жобаларына қолданылады.  Ал Сенгер 1980 жылы химия бойынша  екінші Нобель сыйлығын алады. Жасушалық  ағзаның алғашқы толық геномы болып 1995 жылы  пневмония және минингит тудыратын Haemophilus influenzae  бактерия геномы болған. Бұл бактерия геномы 1830137 нуклеотидтен тұратын ұзындығы болған 1998 жылы көпклеткалы  организім жұмыр құрттың Caenorhabditis elegans   алғашқы геномы табылады. Ал 200 жылы алғаш рет өсімдік  Arabidopsis thaliana  геномы алынады.  Бұл өсімдік  геномында  157 миллион нуклеотидтер ұзындығынан тұрған.Секвенстеудің  өсу ауқымы мен масштабы таңқаларлық  жылдамдықпен өскен.

10. Бактериялық плазмидаларға жалпы түсінік.Плазмидалық векторларға қойылатын шарттарр. pBR322 плазмидалық векторы. 

Ген инженериясының маңызды  мақсаты синтезделген немесе бөлінген генді клеткаға тасымалдау саналады. Бұл мақсат ДНҚ-ның векторлық молекулалары немесе қысқаша векторлар (тасымалдаушы немесе тасығыш) көмегімен іске асады.

Вектор деп бөтен генетикалық  материалды (ДНҚ фрагментін) клеткаға (реципиенттің) тасымалдауға қабілетті  ДНҚ молекуласын айтады. ДНҚ молекуласын  векторсыз, мысалы, бактериялық клеткаға енгізсе, онда оларды бактериялық ферменттер ыдыратып жіберді. Кейбір жағдайда ДНҚ  сақталуы мүмкін. Бірақ клетканың  бөлінуінде олар тұқым қуаламайды. Осындай жағдай болмас үшін векторлық  молекулалар қолданылады. Векторлар  – ген тасығыштар, ал вектор деген  сөздің өзі бағыттағыш деген мағынан  білдіреді. Сонымен бірге векторларды  рекомбинантты ДНҚ-ның міндетті бөлігі деп түсіну керек. Векторларды  эксперименттік жолмен құрастырады  және оларға мынадай талаптар қойылады: 1) вектор клетка ішіне өзімен бірге  бөтен генді алып кірген соң, репликациялана (көбейе) алатын болуы керек, сонда  ғана ол келесі ұрпаққа тұқым қуалай алады, ол үшін векторға ДНҚ репликациясын  бастайтын ерекше нуклеотидтер тізбегін енгізеді; 2) құрамында рестрикатазалар  танып, үзе алатын нуклеотидтер тізбегі  болуы керек, әйтпесе векторға ДНҚ  фрагментін енгізу мүмкін емес; 3) оның бір немесе бірнеше таңбаланған  гендері (маркерлері) болуы керек, сол  таңбалар бойынша қажет геннің қайсы  клетканың (реципенттік) ішіне енгенін  анықтайды; 4) вектордың клетка ішіндегі копиялары (көшірмелері) жеткілікті мөлшерде болуы керек. Ген инженериясында векторлық молекулалардың шығу көзі болып бактериялық плазмидалар  мен вирустар (әсіресе фагтар) саналады. Плзмида және фагтар негізінен бірінші  талапқа сай келеді, ал оларды келесі талаптарға сай келтіру үшін қосымша  генетикалық өңдеу жұмысын жүргізу  керек.