Шпаргалка по "Генной инженерии"

Вектор ретінде мөлшері 15— 20 мың н. ж. дейінгі, көбінесе 2-ден 10 мың н. ж. құралған кішігірім плазмидалар  қолданылады. Плазмидалар бактериялардың хромосомадан тыс генетикалық элементі екендігін және олардың сипаттамасын біз қарастырған болатынбыз. Плазмидалық  векторлар генді бактерияларға  тасымалдап, оның тиімді жұмысын қамтамасыз ете алады.

 Генетикалық инженерияда  Е. Соlі бактериясы үшін көптеген  векторлық плазмидалар құрастырылды. Олардың ішінен әсіресе СоlЕ1  плазмидасының туындылары кең  таралды. Ф. Болвар және Р.  Родригес құрастырған осындай  плазмида — рВR322 бірнеше мың  жұп негіздерден (4362 н. ж.) құралған. Бүл плазмидада антибиотиктер  — ампициллин мен тетрациклинге  төзімділіктің гендері бар және  бірнеше рестриктазалар үзе алатын  сайттары (нуклеотидтік нүктелері)  бар рВR322 плазмиданың құрамында  екі плазмида (рМВ1 және рSС101) және  Тn З транспозоны бар. Ампициллинге  тұрақтылықтың генінде Pst1 рестриктазасына  арналған сайтқа және тетрациклинге  тұрақтылық генінде ВаmН1 және SaL1 рестриктазаларына арналған. Осындай  рестрикциялық сайттарда екі  антибиотиктерге төзімділік гендерінің  болуы қажет ДНҚ-сы (бөтен ДНҚ-сы) бар плазмидаларды сұрыптап алуға  мүмкіндік береді.

 Плазмиданы Ваm1 рестриктазасымен  үзеді де, босаған орынға бөтен  ДНҚ молекуласын (олар да, алдын  ала Ваm1 рестриктазасымен үзіледі)  жалғайды, нәтижесінде рекомбинантты  плазмида тетрациклинді ортада  өсе алмайды, өйткені плазмиданың  tet генінің біртұтастығы бұзылған. Керісінше, плазмида ампицилинді  ортада өсе алады, міне, осындай  ортада көбейетін бактериялардан  қажет генді оңай табуға болады. Бұл арада, вектор антибиотиктерге төзімділік гендері бойынша таңбаланды.

pBR322 векторынан басқа СоlЕ1  плазмидасы негізінде бірнеше  векторлар құрастырылған.Басқа плазмидалар  (рSC101 т. б.) негізінде алынған векторлар  да белгілі.

 СolЕ1 плазмидасы негізінде  құрастырылған вектордың кемшілігі  де бар: бөтен ДНҚ-ның молекулалық  массасы артқан сайын рекомбинанттардың  саны (копиялары) азая түседі. Осы  себептен ұзын ДНҚ фрагменттерінің  (10 мың. н.ж. асатын) клондарын алу  үшін фагтық векторларды, космид  және фазмидтерді пайдаланады

11.Транспозондардың  геномда жылжуының  механизмдері. Транспозаза және оның репрессорлары.

Жылжымалы гендер («секірмелiгендер») – ген бойымен көше алатын құрылымдық және генетика тұрғысынан дербес ДНҚ  кесінділері.Прокариоттарда бір-бірінен  ұзындығы және құрылыс күрделілігімен ерекшеленетін 2 топ Ж. г. бар: 1) инсерциялык  тізбектер яғни Л5 — элементтер, ұзындықтары 1000 қосн уклеотидтерге  тең, құрамында тек өздерінің  жылжуына қатынасатын гені бар; 2) транспозондар  — 3000—20000 қос нуклеотидтерден тұрады құрамында эртүрлі улы заттарғ  атөзімділік көрсететін бірқатар гендерібар.

Ж.Г. геном бойымен жылжуы механизмі түсініксіз. Олар хромосомаларда кездейсоқ орналасады, транспозаза  арқ.орын ауыиырады. Транспозаза дер  ж.г.э.мен ерекше әрекеттесіп, оларды хромосомадан кесіп алатын ферменттерді атайды.

Ж. г. эукариоттарда да көптараған, бұл гендерторшаның генетикалык  материальшьң 5—10% алады. Эукариоттардың Ж. г. хромосома бойына жайылған, олардың  кейбіреулері құрылымы жағынан хромосомаға  енген ретровирустар геномына ұқсайды. Ж. г. ДНҚ бойымен жылжу механизмі  әзір толығынан аныктала қойғанжоқ. Болжам бойынша Ж. г. жылжу репликацияға қатынасатын белоктарды кодтайды. Ж. г. торшада көптеген тұқымқуалайтын өзгерістер береді. Сөйтіп олар торшада  тұрақсыздық пен өзгергіштік  факторлар қызметін атқаратындықтан  эволюцияда маңызды орыналады. Жылжымалыгенетикалық элементтерді 1947 жылы америка ғалымы Барбара Мак-Клинток жүгерідегі тұқымқуалаушылықты зерттеу нәтижесінде  анықтады. Бұл жаңалық көпке дейін  мойындамалды. Хрососоманың бір бөлігі алынып басқа хромосомаға енуі өте  түсініксіз жағдай болды. Дегенмен де осындай элементтердрозофилла шыбынынды  да байқалды. Оны ең алғаш рет 70-жж.Г.П.Георгиев пен  В.А.ГвоздевМәскеудеанықтаған. Осы жаңалық негізінде Мак-Клинтоктың дұрыс екеніндігіне көзжетіп, осы  элементтер басқа да организмдер  де анықталды. 50-жж беріжылжымалы генетикалық  элементтер туралы көптеген мәліметтержиналуда. Бқлэлементтергеномда міндетті түрде  болуы шарт емес.  Жылжымалы элементтердің 50-ге жуығы дрозофиллада байқалған.  Сүтқоректілердің геномында 50000 көлемінде 6500 ж.н. LineВ ретропозон кездеседі. Сонымен  қатар 300-500 ж.н. Аlu қайталамалы түрі де жылыжымалы элементтерге жатады. Құрылысы және ену ерекшеліктеріне байланысты МГЭ-дің бірнеше класстары кездеседі:

Транспозон, мысалы, Tn5;  

Инсерциондыэлементтер, мысалы , IS1603;

 ДНК-транспозондар (антибиотикке төзімділік)

Эукарриоттарда: ретроэлементтер(ретротранспозон, ретропозон- LINE, SINE).

Ретротранспозондардың транспозийиясына кері транскриптааза қатысады.Ретровирустар  ретротранспозондардың прототипі б.т.

Плазмидтер, мысалы, ішек таяқшасының  жыныстық факторы (F-плазмида);

Бактериофагтар, мысалы, Mu,геномның кез келгенбөлігіне интеграцияланады; МГЭ-нің клеткаға енуі үшін ферменттеркездеседі. Олардың генге енупроцесін транспозиция деп атайды. Хромосоманың әртүрлі  бөліктеріне ене отырып, олар геннің активтілігін өзгертеді, әртүрлі типтегі  мутацияларды тудырады,геномның тұрақтылығын бұзады.

Эукариоттардың ЖГЭ-сін  транспозондар деп те атауғаболады.

Жылжымалы генетикалық элементтер қожайын клеткасында әртүрлі  мутациялар туғызатын «генетикалықпаразиттер»болғанымен олар өзгергіштікті тудыратын және түрішінде немесе түрарасында генетикалық материалдармен алмасуға көмектесетін өте маңызды механизм болып табылады.

Ретротранспозон-Ретротранспозон LINE-1 – жылжымалы элемент. Ол эволюция нәтижесінде көп рет қайталанды, соған байланысты қазіріг кезеде адам геномының 17% LINE-1 тізбегінің қайталануынан  тұрады.

  Ретротранспозон LINE-1 өзі көбейіп қана қоймай, сондай-ақ  бір миллиона Alu-тізбегін (басқа паразит  ген) геномға енгізуге де жауапты. Alu-тізбегі тек жоғары приматтарда  ғана кездеседі және олар геномның 10% -ын алып жатады.

12Андинелердің структуралық ерекшеліктері.  Антиденелердің V- және C- сегменттерінің генетикалық бақылануы

Антиденелер немесе қарсыденелер — адам мен жануарлар организміне енген жат бөгде ірі молекулалы протеиндік заттарға (антигендерге) қарсы иммундық реакциялар нәтижесінде түзіліп, олардың зиянды әсерлерін жоятын протеиндік заттар (негізінен гамма-глобулиндер); адам жәнежылықанды жануарлар денесінде пайда болған антигендерге қарсы қан плазмасында түзілетін ақуыздық заттар. Антиденелер ағза иммунитетінкүшейтуде маңызы үлкен

Антиденелерді лимфоциттер  мен плазмоциттер бөледі. Қарсьщенелерге тән қасиет — тек өздерінің  түзілуіне әсер еткен антигендермен  ғана әрекеттесіп, оларды жояды. Антиденелер  — организмде қан сарысуы мен ұлпаларда жинақталады. Қарсыденелер антигендермен әрекеттесу сипатына қарай агглютининдер, гемолизиндер, бактериолизиндер, преципитиндер болып бірнеше топтарға бөлінеді.

Антиденелер қанда болатын  белок заттары - иммундық глобулиндер  денеге кірген басқа бөтен заттардың  әсерінен пайда болады. Ол заттарға бактериялар, вирустар, басқа текті  белокты заттар жатады. Оларды антигендер деп атайды. Антитоксиндер — уланған  кезде организмде пайда болатын  усыздандырушы заттар. Антиденелер, антитоксиндер мен антигендер - өте  өзгеше үйлесімді заттар, яғни әр антигеннің немесе токсиннің өзіне ғана үйлесетін  антиденелері мен антитоксиндері болады. Олар бір-біріне кілттің құлыпқа  сай келетіні іспетті. Антиденелер  ауру тудыратын микроорганизмдерді бір-біріне жабыстырып, енді біреулерін ерітіп жібереді. Денеге бөтен заттар, айталық шешек вирустары енісімен организм сол вирустарға қарсы антидене түзеді. Олар вирустармен күресіп, организмді қайталап аурудан сақтап қалады. Иммунитет  табиғи және жасанды болып бөлінеді. Табиғи иммунитет адам ауырғанда  пайда болады да, сол аурумен екінші рет ауырмайды. Табиғи иммунитеттің ұзақтығы әртүрлі. Кей ауруларға (мысалы, шешек) иммунитет өмір бойы сақталады, ал кейбіреуінің иммунитеті қысқа мерзімдік  болады (мысалы, грипп). Жасанды иммунитет  ауырған адамның немесе жануардың қанынан алынған дайын антиденелерді немесе әлсіздендірілген антигендерді егу арқылы жасалынады. Осылай кейбір аурулардың алдын алуға болады. Иммунитеттің т у а және ж ү р е пайда болған түрлері де бар. Мысалы, кейбір жануарлардың аурулары адамға жұқпайды, себебі адам организмінде тұқым қуалаған сол ауруларға қарсы тұру қабілеті болады. Иттің немесе шошқаның обасы адамға жүқпайды. Бұл - туа болатын иммунитет. Ал жүре болатын иммунитетке адам ауырғаннан кейін немесе түрлі екпеден кейін пайда болған жасанды қабілет жатады. Иммунитетті жалпы және жергілікті деп те бөлінеді. Бүкіл организмнің ауруға қарсы тұру қабілеті жалпы иммунитетке, ал жеке бір ұлпалардың немесе мүшелердің қабілеті жергілікті иммунитетке жатады. Иммунитеттің жас ерекшеліктері. Қазіргі кезде ана құрсағындағы ұрықтың қанында антигендер болмайтыны анықталды. Ұрық плацентасының қорғаныс қабілетіне байланысты оның денесінде ешқандай антиденелер өндірілмейді, бірақ анасының қанындағы антигендерді плацента ұрыққа өткізбейді. Ал бала туған сәттен бастап сыртқы ортадағы көптеген микроорганизмдерге қарсы тұру қабілеті дами бастайды. Бірақ алғашқы 3 айдың ішінде бала организмі анасынан алған антиденелердің әсерінен ауруға төзімді болады. Алғашқы кезде сәбидің денесінде антиденелер аз өндіріледі, өйткені ондай антиденелер ана сүтінің құрамында болады. Баланың иммундық қабілеттері күшті дамитын кез 1 жастан 10 жасқа дейін, онан әрі 20 жасқа дейін иммундық қорғанысы біршама төмендейді де 20 жастан 40 жасқа дейін тұрақталады, ал 40 жастан аса біртіндеп нашарлай бастайды. Әсіресе жыныс мүшелерінің қызметі әлсіреген кезде иммундық қабілет те төмен болады. Балалар мен жас өспірімдердің ауруларының алдын алуда арнайы екпелердің маңызы зор: 1. Туберкулезге (коксауға) қарсы бірінші екпе 5-7 күндері жасалады да, 7, 12, 17 жаста қайталанады. 2. Полиомиелитке қарсы бірінші екпе 2 айда жасалып, 1, 2, 3, 7, 15-16 жаста қайталанады. 3. Дифтерия (күл) мен көкжөтелге (коклюш) қарсы бірінші екпе 5-6 айда, 2-3 және 6 жаста қайталанады. 4. Шешекке қарсы бірінші екпе 1-1,5 жаста, 8 және 15 жаста қайталанады. Бірақ соңғы кездерде Бұл аурудың толық жойылуына байланысты қазір Мұндай екпені жасамайды. 5. Қызылшаға қарсы 10 айдан бастап 8 жасқа дейін бір рет қана егіледі.

13.l - бактериофагының  литикалық және лизогениялық  даму жолдары. l - бактериофаг геномы  негізіндегі векторлар.

Вектор ретінде   бактериялармен қатар вирустар да қолданылады. Олардан вектор алу әдістемесі лямбда (λ) фагында жете зерттелген. Лямбда фагтың ДНҚ-сы қос тізбекті және формасы түзу, оның геномы 48,5 мың н. ж. тұрады. Фаг ДНҚ-сының 12 н.ж. құралған комплементарлы жабысқақ ұштары бар. Олар, фаг клеткаға енгеннен кейін бір-бірімен бірігіп, ДНҚ сақиналы формаға   ауысады. Сақиналы ДНҚ   репликациялық форма болып саналады. Лямбда фагтың ДНҚ                                                                                                                                                                                                                 

молекуласында 60-тай ген  бар. Фагтың геномында лизистік даму мен ұрпағын көбейту үшін қажет  гендері (маңызды) жоқ екі учаскесі бар. Бірінші учаске фаг геномының  орталық бөлігінде    (маңызды   емес   гендер) орналасқан,   оның      ұзындығы 22,0 мың  н.ж. тең, екінші учаске P мен Q                                                                                                                                                                                                 гендері арасында орналасқан, ұзындығы 3,0 мың н. ж. тең.Міне, осы бөліктерді бөтен ДНҚ молекуласымен ауыстыруға болады. Лямбда фагтың вектор ретінде кең таралуы осы қасиеті мен ерекшелігіне байланысты, бұдан басқа оның орташа фаг екендігі бұрыннан белгілі.

Сонымен фагтың басына 25.0 мың  н. ж. құралған бөтен ДНҚ-ны енгізуге болады. Фагтың қалыпты геномы 48,5 мың  н.ж. құралғанымен, оның басына 38,0 мын, н.ж. кем емес және 53,0 мың н. ж. артық емес ДНҚ жинала алады, фагтың белокты капсиды ДНҚ-ның осындай мөлшерлерін қоршай алады. Лизистік дамуға қажет ген 29,0 мың н.ж. тең болғанымен, вектордың қалыпты тіршілік етуіне қажет фаг геномының мөлшері 38,0 мың н.ж. кем болмауы керек. Ғалымдар қазіргі кезде лямбда фагтың негізінде аталған шектеулер мен фаг қасиеттерін ескеріп, түрлі рестриктазалардың көмегі бірқатар векторлық молекулалар құрастырды: харон — λфаг, λgt — фаг, ЕМВ1З, λFIХ, λZАР және т. б.

Кейінгі уақытта жалғыз тізбекті ДНҚ -сы бар фаг — М1З негізінде де жақсы векторлар алынды. Жетілген М1З фагының жалғыз ДНҚ молекуласының ұзындығы 6,5 мың н.ж. тең. Клеткаға енгеннен кейін қос тізбекті репликациялық формаға айналып, өзінің 100—200 көшірмесін синтездейді. Ары қарай асимметриялы синтез жүреді: жетілген фагтың құрамына кіретін жалғыз тізбекті ДНҚ ғана синтезделеді. М1З фагы клетканы лизиске душар еткізбейді, бірақ оның бөлінуін бәсеңдетеді. Осының нәтижесінде жетілген фагтар клеткадан ортаға үздіксіз бөлініп тұрады. М1З фагының вектор ретінде негізгі артықшылығы жалғыз тізбекті векторлық ДНҚ-ны ыңғайлы жеке күйде тасымалдай алу қабілетіне байланысты. Мұндай ДНҚ-ның нуклеотидтер қатарының Сэнгер әдісімен

тез анықталуы генетикалық  эксперименттерді жеңілдетеді. Тағы да, қазір пайдаланылатын барлық векторларға  қарағанда, оларды бөлу және көшірмелерін алу оңайға соғады.

Жоғарыда баяндалғандардан фаг негізінде алынған векторлардың бірнеше артықшылықтарын байқауға болады. Бірақ, олардың сыйымдылығы  шектелген, сондықтан рекомбинантты  ДНҚ-ны молекулалық массасы бойынша  іріктеу керек. Мұндай кемшілік космид деп аталатын векторлық молекулаларда  кездеспейді

14. Космидті векторлардың  конструкцисы .

Космид — лямбда фагтың соs — учаскесі (жабысқақ ұштар) бар плазмида яғни тіршілігі екі жақты ДНҚ-ның гибридтік молекуласы. Оларды алғаш   рет 1978 ж.. Дж. Коллинз бен Б. Хон ашты. Космидтік плазмидалық бөлігі оның бактерияларда репликациялануына мүмкіндік береді, ал лямбда фагтың геномына   жататын бөлігі -— соs тізбек — космидтің фаг капсидінің ішіне  in vitro жағдайында оралуына және реципиенттік клеткаға трансдукциялануына мүмкіндік береді. Сонымен, космидтер клеткаға трансформация жолымен емес, кәдімгі   инфекция арқылы   ене алады. Мұның өзі   трансформация процесінің тиімділігін ең аз дегенде 100 есе арттырады.

Космидтік векторларда мөлшері 33—49 мың н.ж. бөтен ДНҚ фрагменттерін  көбейтуге болады. Космидтер сыйымдылығы  ең үлкен векторлар, сондықтан эукариоттық  ДНҚ-ның үлкен фрагменттерінің  көшірмелерін және геномның гендер банкісін (жинағыш) клондардың ба-рынша аз санымен  алу үшін арнайы құрастырылған.

Космидтік вектор дегеніміз  бойында плазмидалық, лямбда бактериофагы негізіндегі векторларға тән  белгілері бар. Космидті клондаушы  векторға қойылатын шарттар: автономды  ркпликация үшін керек ori ауданы, антибиотикке төзімділікті қамт.ететін СМГ; Рестрикциялық  эндонукклеаза сайты; жабысқақ соңды  ДНҚ фрагменті (cos сайт); және көлемі кіші болу керек, 30м.ж.н.клондауға мүмкіндік  болу үшін. Космидтердегі клондау  принципін Дж.Коллинз бен Б.Хон  ұсынды (1978 г.). Белгілі рестриктазамен гидролизденген космидті және клондалушы ДНҚны лигирлейді, космид жоғары концентрацияда болады. Лигазды реакция өнімдерінің арасында клондалушы ДНҚсы бар , екі ұшында cos сайттары орналасқан молекулалар пайда болады.

Бұндай молекулаларды  лямбда фагының ДНҚсымен инкубирлегенде, cos сайтқа фагтың ферменттерінің әсерінен біртізбекті жабысқақ соңды ДНҚ  пайда болады. Осы пайда болған ДНҚ молекулалары фагтық капсидпен  оралады.  Гибридті ДНҚ клеткаға енген соң, жабысқақ соңдарымен циклденеді, плазмида сияқты репликацияланады, және белгілі антибиотикке төзімді болады, яғни лизогения немесе литикалық  жолмен жүрмейді.  Гибридті ДНҚ in vitro   оралғанда, ДНҚ мөлшері 38-51м.ж.н.құрайтын гибридтер таңдап алынады. Көп қолданылатын космидті вектордың мөлшері 4-6м.ж.н., сон.тан оған ұзындығы 35-45м.ж.н. болатын   ДНҚ фрагментін клондауға болады.