Шпаргалка по "Генной инженерии"

15. Ұзын ДНҚ кесінділерін клондауға арналған жасанды хромосомалар (YAC вектор).

YAC (yeast artificial chromosome) . Жасанды  хромосома – геномдық библиотека жасауға және клондау  үшін пайдаланады.  100 мыңнан астам ДНҚ кескінін клондауға арналған

YAC-вектор ДНҚсы сақиналы  түрде б.т., оның вектор болуын  қамтамасыз ететін генетикалық  элементтері бар: 

-вектордың екі теломерлі  TEL нуклеотид тізбектері бар, ол  мини хромосоманың соңдарын репликациялауға  керек.

-репликация басталатын ARS1 ауданы, ол центромер тізбегімен жалғасады. Бұл екі элемент те вектордың дұрыс репликациялануына және келесі ұрпақтың ядросына митоз кезінде дұрыс берілуін қамт.етеді.

-екі СМГ бар  TRP, ол  тирптофан синтезіне керек СМГ

- URA3 маркері ашытқы клеткасының  урацил биосинтезін бұзатын генетикалық  дефектін компенсирлейді

-супрессорлық тРНҚның  гені sup4, ол вектордың мутантты  бактерия клеткасында сақталуын  қамт.ететін СМГ. Одан басқа,  вектор құрамында оның бактерия  клеткасындағы репликациясын қамт.ететін  нуклеотид тізбектері бар.

YAC-векторді клодауға дайындау  үшін этаптар:

1. ВаmHI рестриктазамен өңдеп, сызықты күйге келген соң, репликацияға керек емес фрагменттен құтыламыз.
2. EcoRIмен өңдеп, оның екі «иығы» түзіледі, және оның соңдарында ашытқы хромосомасының теломерлі тізбектерібар.
3. «Иықтарды» клондалушы ДНҚның ірі EcoRI фрагменттерімен лигирлейді.

Осындай жолмен алынған трансформанттарды  селективті қатты қ.о.да бөліп алады. 

Кемшіліктері:

-ішкі делеция болуы  мүмкін.

-бір клеткаға екі вектор  енетін болса, олардың арасында  өзара рекомбинация процесі жүріп,  химерлі молекуланың тууына алып  келеді. Бұл зерттелетін объектінің  хромосомадағы физикалық картасын  жасауды қиындатады.

16. РНҚ- лы онкогендік вирустардың (ретровирустар) ұйымдасу ерекшеліктері.Онкогендік вирустар негізіндегі векторлар.

 ДНҚ және РНҚ – сы бар вирустар тіршілік циклдері бойынша соншалықты айырмашылығы болмайды.Ең бастысы екіншісінде ДНҚ – ның транскрипция  сатысы өтпейді,яғни онда РНҚ  молекуласы синтезделмейді.РНҚ- сы бар вирустардың генетикалық информациясы РНҚ –да коделенген, РНҚ бір немесе екі тізбекті болуы мүмкін, ал оның иесі – клетка – прокариоттық (бактерия) немесе эукариоттық  (жануар не өсімдік ). Бактерияларға тек жалғыз тізбекті фагтар ғана енеді.Ал, жануарлар мен өсімдіктердің вирустары жалғыз – не қос тізбекті болуы мүмкін.

Жалғыз тізбекті РНҚ –  лы вирустар

екі типке бөлінеді: «оң» тізбекті және  «теріс» тізбекті.  «Оң» тізбекті вирустар иесінің клеткасында  кәдімгі иРНҚсияқты қызметін жүргізеді, ал  «теріс» тізбекті вирустар, алдымен  клетканың РНҚ – полимеразасының  көмегімен  «оң» тізбек түзуі қажет.

РНҚ – сы бар вирустардың  бір тобы ретровирустар деп аталады,олардың  генетикалық материалының құрылысы мен қызметінің өзіндік ерекшелігі бар.Ретровирустар табиғатта  кең  тараған, бұларға тауық пен тышқанда лейкозды және адамға ҚИЖС (орыс .СПИД – қабылданған иммуножетімсіздік  синдромы ) ауруын қоздыратын вирустар жатады. Ретровирустар тек жануарлар  клеткасына ғана жұға алады.Олардың  құрылысының басқа РНҚ – лы вирустардан айырмашылығы мынада : қос «оң» тізбектерден құралған диплоидты  геномы бар.

Ретровирус негізіндегі  векторға он мың жұп нуклеотидке  дейін фрагментті клондауға болады. Сонымен қатар оның инфицирлеуі 100% нәтиже береді. Құрамында транскрипцияны күшейткіш элементтер бар. Вирион құрамына 5-8 полипептид кіреді,соның ішінде  1-3 қабықшаның гликопротеиндері. Капсид ішінде ондаған кері транскриптаза молекулалары, тРНК мол, екі геномдық біртізбекті РНҚ молекулалары, ұзындығы 3.5-9 мың нуклеотид бар. Ретровирустың геномдық РНҚсында инфекция жүргенде, ревертаза көмегімен кДНҚ түзіледі. Ол кейін клетка геномна интеграцияланады да, провирус түзеді. ДНҚ мол.синтезіне праймер керек, оны тРНҚ праймер атқарады. Ол вирусты РНҚның 5’ ауданындағы PB- (primer binding) сайтымен байланысады. Онымен ревертаза әркеттесіп, ДНҚ молекуласының минус тізбегін түзеді. РВ + учаскесінде екінші комплементарлы плюс тізбек синтезделеді. Вирустың қостізбекті ДНҚ молекуласының синтезделуі күрделі механизм.

Ретровирус негізіндегі  векторды құрастырудың үш негізгі әдісі  бар:

1. Провирусты ДНҚ құрамынан структуралық белок және ревертаза гендерін жоғалтады, оның орнына рестрикция сайттарын енгізеді.  Ретровирустың цис әсер етуші гендері өз орнында қалады.Бұл векторға мысал pMX1112 плазмидасы.Олар инициация сигналдарының арқасындаэкспрессияланады.
2. Бізді қызықтыратын геннен басқа гибридті ретровирус геномына СМ енгіземіз, ол доминантты типте болу керек. Бұл клонды клеткаларды сұрыптауды жеңілдетеді. Ондай маркер ретінде neo гені қолданылады, оның қолайлылығы- G418 антибиотигінде төзімділігінде және ол арнайы қ.о. керек етпейді. pMX1122 мысал б.т.
3. Гибридті ретровирусқа екі бөтен ген енеді: қызықтыратын ген, доминантты СМ. Бір ген векторлы ретровирустың промоторы арқылы транскрпицияланады, ал екіншісі кез келген жануардың ядросында транскрипцияны жүзеге асыра алатын промотор арқылы экспрессияланады. pZipNeo мысалы.

17)Рекомбинантты ДНК ны прокариот жүйелеріне транформациялау әдістері.Гендік инженерияның маңызды мақсаты снтезделген генді клеткаға тасымалдау.

Трансформация деп донорлық клеткадан бөлінген ДНҚнің реципиенттік клеткаға енуін айтады. Ол хромосомалық немесе плазмидтық болуы мүмкін. Егер бактериялық клеткаға фагтың бөлінген ДНҚсы кіріп, онда жаңадан фагтың пайда болуына әсер етсе, оны трансфекция  дейді. Трансформацияны зерттеу  нәтижесінде 1944ж.ДНҚның генетикалық  материал екені дәлелденген. Траняформация  болу үшін реципиенттік клеткалар компетенттік жағдайда болу керек. Компетенттік клеткалар ДНҚны сорып және сіңіріп алады. ДНҚны кез келген клетка сорып алады. Бірақ клеткаға сіңу үшін ДНҚ клетка қабығында рецептормен байланысып беку керек. Рецептор мен ДНҚның бір ұшы байланысады. ДНҚ мен байланысатын рецепторлардың саны 20дан  200 дейін болады. ДНҚ клеткаға кірерде екі тізбектің біреуі ыдырап, екігші тізбек клетканың ішіне ауысады. Осы тізбек рецепиент ДНҚның гомологиялық комплекс жасайды. Бұл кезеңді синапсис дейді. Екі ДНҚның арасаында сутегілік байланыс түзіледі. Содак кейін трансформациялайтын ДНҚ рецепиенттік хромосомамен бірігеді, ал соған сәйкес , яғни донорлық ДНҚға сәйкес хромосома ДНҚның бөлігі алынып тасталады. Нәтижесінде рецепиенттік хромосомада гетеродуплекс пайда болады. Бір тізбегі донорлық, екігшісі рецепиенттік ДНҚға жатады.

Прокариоттардағы трансформация  түрлері:

1.Температуралық шок негізіндегі  т.я

Рецепиентті CaCl2 мен инкубациялаймыз. Температураны +42C көтереміз. Бактерия мембранасын жыртады, сол жерден рДНҚ кіреді. Бірақ мембрана жыртығы  тез репарацияланады, ол бірнеше  секунд алу мүмкін.

2. Электропорация

Рецепиентке рДНҚны енгізіп, электр өрісіне қояды. 2мВ ток береміз. Ток мембрананы соғады, жыртылады. Ол 1 сек.төмен уақыт алады.

Трансформациялану эффективтілігі. – 1 микрограм ДНҚ негізінде п.б. трансформацияланған клетка саны.

18)кДНКсинтезіжәнеоныклондау.Керітранскриптазаферментінесипаттамажәнеолардыңқолданылуы.

. кДНҚ молекуласын синтездеу қос тізбекті ДНҚ молекуласының бірінші және екінші тізбегін синтездеуден басталады. кДНҚ-ның бірінші тізбегінің синтезі кері транскриптаза ферменті көмегімен жүзеге асады ( РНҚ – ДНҚ полимеразаға тәуелді).  Ал кДНҚ-ның екінші тізбегі синтезі бір тізбекті кДНҚ молекуласының 3'- соңында шпилька тәрізді құрылым пайда болуымен сипатталады, ол ДНҚ полимераза I және кері транскриптазаның көмегімен кДНҚ-ның екінші тізбегінің синтезінде ұйытқы есебінде қолданылады.  Бір тізбекті кДНҚ синтезі. Синтез кезінде м РНҚ келесі жағдайларды қолданады: Кері транскриптаза, рН 8,3,Бір ковалентті және екі ковалентті катиондар; Дезоксирибонуклеозидтрифосфаттар (эффективті кДНҚ синтезі үшін әрбір төрт дезоксирибондар жоғары концентрациялы болу керек. Егер олардың ішінен біреуінің концентраңиясы төмендейтін болса 10—50 мкМ, онда толық көлемдегі транскриптердің шығуы кішірейеді.1964 жылы Г.Тиминнің гипотезасы бойынша кері транскриптаза РНҚ- тұрақты ретровирустық фермент және матрицалық РНҚ-ның негізінде ДНҚ-ның синтезделуі.1970 жылы Г.Темин және С.Мизутани сонымен бірге Д.Балтимор бұл ферменттің Раус саркома вирусында бар екенін анықтады. Сонымен бірге ревертаза құстардың вирустарында да кездеседі, олар екі суббөліктен тұрды. Альфа ( 65кДа) және бетта(95кДа). Активтілік қасиет көрсетеді. ДНҚ полимераздық ( РНҚ-ны ДНҚ сияқты матрица ретінде қолдана алады); РНКаза Н активтілігі(РНҚ гибрид құрамында РНҚ:ДНҚ қатынасын гидролиздейді, бірақ бос РНҚ-ға қысым жасамайды);ДНҚ – эндонуклеаздық активтілік көрсетеді. Бастапқы екі активтілік ДНҚ синтезі үшін қолданылады. Ал эндонуклеаздық активтілік Генетикалық инженерияда ревертаза ферменті кДНҚ молекуласын(матрицалық РНҚ комплементарлы ДНҚ молекуласына) синтездеуде кең қолданылады. Сонымен қатар кДНҚ молекуласын синтездеу үшін басқада ферменттер қолданылады (поли(А)-полимеразалар, Кленова фрагменті ДНҚ полимераза I және нуклеаза S1). Бұл мРНҚ ның ДНҚ-ң комплементарлы тізбегіне ранскрипциялау үшін қолданылады. 1964 жылы Темин спецификалық ферменттің вирусы бар екені туралы гепотеза жасады.  1970 жылы Темин мен Мизутани және Байтимор искомый ферментті клеткалық емес Рауса саркалы вирусының варионынан ашты. Бұл РНҚ-тәуелді ДНҚ-полимераза кері транскриптаза немесе ревертаза атауын алды. Құстардың ретровирусының ревертазасы зерттелді. Әрбір вирион осы ферменттің 50-ге жуық молекуласын құрайды. Кері транскриптаза 2 суббірліктен : -а (65кДа); -в (95 кДа) тұрады. Кері танскриптаза 3 ферментативті активтіліктен тұрады.1. ДНҚ-полимеразалық, РНҚ, ДНҚ сияқты матрица ретінде қолданады. 2. РНҚ Н активтілік,РНҚ-ДНҚ гибридіндегі РНҚ-ны гидролиздейді. Бірақ бір емес немесе қос тізбекті РНҚ-ны. 3. ДНҚ- эндонуклеаздық активтілік. Алғашқы 2 активтілік вирустың ДНҚ синтезіне қажет, ал эндонуклеаза қожайын клетка геномына вирустық ДНҚ-ны интеграциялауға керек. Ревертаза жүру үшін праймер керек. Праймер ретінде РНҚ,ДНҚ сияқты бір тізбекті сегмент қолданылады. Олар реакция кезінде ДНҚ-ның жаңадан синтезделген тізбегімен ковалентті байланысады.

19.Селективті және репортерлі  гендер негізінде трансформацияланған клеткаларды сұрыптау.

Селективті гендер арқылы трансформацияланған клеткаларды  табуға болады. Ол негізінен қай  маркерлік генге  ДНҚ фрагментті еңгізілуне байланысты табуға болады. ДНҚ фрагменті таңдалған селективті маркелік генді бұзып ораналстырылады. Алғашында бұзылмаған селективті макерлік гені жауап беретін антибиотигі  бар ортаға клетканы өсіріледі, өскен  барлық генді маркермен белгілеп оны метод печатка арқылы екінші ДНҚ фрагменті орналастырған  селективті маркерлік генге жауап  беретін антибиотигі бар ортаға егеміз. Өсіп шыққан колония трансформацияланбаған, өспеген колониялар трансформацияланғанын  анықтауға болады. Себебі ДНҚ фрагменті  селективті маркерлік генді толығымен  бұзып оның қызметін жояды.Бұл негізінде  прокариоттар жүйесінде қолданылады. Ал эукариоттар жүйесінде селективті гендер негізінде трансформацияланған  клеткалардың анықтаудың басқаша жүргізіледі. Алдымен рекомбинантты ауксотофты организмдерді алады. Яғни минимальді заттары бар ортада өсіру арқылы. Осы арқылы кез келген минимальды заттары бар ортада өскен колония  трансформацияланған. Себебі трансформацияланған  векторда сол кез келген минимальды затқа жауап беретин гені бар. Мысалы ашытқы жүйесіндегі лецинге  жауап беретін маркерлік ген.Трансформацияланған клеткаларды сұрыптау үшін маркерлик гендер кажет. Маркерлик гендердин еки түрі бар? 1)селективтік гендер: 2)репортерлық гендер. Селективтік гендер жасушага антибиотикке (канамицин, неомицин) төзімділік белгисин береди. Сүтқоректілердің трансфицирленген клеткаларын алу үшін Neo^r бактериалдық гені қолданылады. Бұл жүйеде сүтқ-ң трансфицирленбеген клеткаларындағы трансляцияны тұйықтаушы токсикалық генетин (G-418) байланысы қолданады. Бұл кезде G-418 трансфицирленген клеткалары неомицинфосфотрансферазамен фосфорилденеді және инактивацияланады. Нәтижесінде Neo^r генінің өнімін синтездейтін клеткалар ғана тірі қалады. Сүтқ-ң трансфицирленген клеткаларын алудың басқа жүйесі  дигидрофолатредуктаза ферментін кодтайтын (DHER) генді қолдануға негізделген. Бұл жүйеде DHER гені дефектісі бар клеткалар және DHER синтезделмейтін клеткалар қолданылады. DHER клеткаларының трансфекциясынан кейін ортаға метотрексад қосады. Трансфицирленбеген клеткалар ол бар кезде өспейді, ал DHER синтездейтін клеткалар тірі қалады. DHER гені бар клеткаларды сұрыптағаннан кейін метотраксад концентрациясын жоғарылатады және рекомбинантты белокты өте көп мөлшерде синтездейтін көптеген вектор копиялары бар клеткаларды сұрыптайды. Доминантты маркермен сұрыптаудың басқа да схемалары жасалған. Мысалы, глутамин синтетаза (GS) ферментінің қатысуымен. Бұл фермент метионинсульфокселиннің цитотоксикалық әсеріне төзімділікті қамтамасыз етеді. Бұл жүйеде GS гені бар вектор қолданылады. Оны сүтқ-р клеткалардың культурасына енгізеді және клетканы сұрыптау үшін ортадағы метионинсульфокселин конц-н жоғарылатады.

Репартерлық гендер тіркелуге  оңай гендер.

• Гликоуронидаза гликоуронид гидролиздейді. Субстарты ретінде хромогенді зат. Pнитрофенил bглюкоуронид. Термотұрақты рН 5-9 . Термотұрақты болып келеді. Ішек таяқшасынан бөлініп алнған.
• Жасыл флюроцентті белок. Люминиценциялайтын медузалардан бөлінген
• Люцефераза көк түсті люминицентейтін репортерлық ген
• Хлороаминоацетилрансаминаза ішек  таяқшасынан бөлініп алынған. Субстраты ретінде хромогенді зат.
• X-gal-хромогенді субстрат негізінде Pнитрофинилbгалактазид

20.Трансформацияланған клеткаларды айқындау. Саузерн және Нозерн блотинг әдістері

1.Сонымен біз қажет  гені бар ДНҚ фрагментін бөліп  алдық, алайда, ол әлі де болса  геннің өзінен ұзындығы бойынша  бірнеше нсе үлкен. Фагтық вектордың  ішіне орта есеппен 15—20 мың  н.ж. сиятындай етіп құрастырылатыны  естеріңізде болар, ал геннің  орташа ұзындығы — 1-2 мың н.  ж. Міне сондықтан да жеке  генді бөлу жұмысы осымен аяқталмайды.  Гендер жинағынан бөлінген ДНҚ  сегментін қайтадан әр түрлі  рестриктазалармен үзеді, осының  нәтижесінде ұзындығы бойынша  әр түрлі рестриктер немесе  ДНҚ үзінділері алынады. Алынған  үзінділерді электрофорезден өткізеді, мұның нәтижесінде олар агарозалық  гельде ұзындығына сәйкес таралады: үзінді қысқа болған сайын,  ол электр өрісінің әсерінен  агарозалық гельде жылдам қозғалады.  Осындай гельді бром этидиімен  бояп, оның суреті бойынша рестрикттердің  ұзындығын анықтайды. Бұдан кейін  жауапты кезең — ДНҚ-ны денатурациялау  арқылы жалғыз тізбекті үзінділер  алып, оларды нитроцеллюлозалы сузгіге  ауыстыру басталады. Ол үшін  электрофорез аяқтала салысымен  агарозалық гельді тұздың қанықтырылған  ерітіндісіне батырып, сүзгі қағаздың  үстіне орналастырады. Гельді  нитроцеллюлозамен жабады, ал олардың  үстіне бірнешн құрғақ сүзгі  қағаздарын салып престейді. Тұз  ерітіндісі құрғақ сүзгі қағазына  сіңеді, ол үшін ерітінді гельден,  онан соң нитроцеллюлозалы сүзгіден  өтуі керек. Гельдегі ДНҚ үзінділері  ерітіндімен бірге тасымалданады,  бірақ нитроцеллюлозалы сүзгіде  тұтылып бекінеді. ДНҚ үзінділерінің  нитроцеллюлозалы сүзгідегі орындары  электрофорез пластинкасындағы  орналасу тәртібіне дәлме-дәл  келеді. Сонымен электрофорездегі  рестриктер таңбасы нитроцеллюлозалы  сүзгіде алынды. Бұл әдісті Саузерн Э. ұсынды, сондықтан ол Саузерн блотинг (ағыл. to blot— қағазға сорылу) деп аталады. Саузерн бойынша блотинг әдісінің маңызы жалпы геномнан жеке гендерді бөлуде арта түседі. Бұл молекулалық деңгейдегі күрделі жұмыс үлкен мұқияттылықты керек етеді. Мысалы, сүтқоректілер клеткасының геномы 10⁹ н.ж. құралған болса, онда ұзындығы тіпті 5000 н. ж. тең жалғыз ген геномның бар болғаны ядролық ДНҚ-ының 0,00005 %-ін ғана құрайды. 
Әдісті РНҚ үшін де қолдануға болады. Мұнда гибридизация өткізу үшін бірқатар өзгерістер енеді. Бұл әдіс Нозерн блотинг деп аталады (Саузерн — оңтүстік деген мағынаны білдірсе, керісінше Нозерн-солтүстік әдісі де-ген атау пайда болды). Қалған операциялар генотеканың скринингісіндей өтеді: нитроцеллюлозалы сүзгіде ДНҚ денатурацияланып, радиоактивті сүңгімен гибридизацияланады және қажет ген орналасқан ДНҚ үзінділері радиоаутографияның көмегімен табылады. 
 
Рекомбинантты ДНҚ технологиясында шоғырларды гибридизациялау әдісінен басқа