Шпаргалка по "Генной инженерии"

ДНҚ транскрипциялы аймағы, яғни промотор мен терминтатор арасында орналасса транскрипция бірілігі немесе транскриптоном деп аталынады. ДНҚ  транскрипциялы аймағы, яғни промотор мен терминтатор арасында орналасқан транскрипция бірлігі немес транскриптон деп аталынады, ал түзілген РНҚ алғашқы  транскриптат делінеді.

Прокариоттарда алғашқы  транскриптатта РНҚ-ның көшірмесі  бірнеше гендерден тұрады, ал эукариоттарда  – біреу ғана.

РНҚ полимеразаның бірнеше  типтері белгілі. РНҚ-ның транскриптаттың 5^/ - соңы синтезделінеді, содан кейін кэпирленеді. Кэпирлену – бұл белгі нуклеотидтердің бірізділігінің қосылуы. Кэпирлену қызметі – РНҚ транскриптатаны бұзылудан қорғау және рибосомамен байланысады. Одан трансляция басталады,сосын кэп алынып тасталынады.

Элонгация кезеңі немесе РНҚ – транскриптатының ұзаруы. Бұл кезде ДНҚ тарқатылып және нуклеосома бұзылады. Синтез жылдамдылығы – секундына 30 нуклеотидтер. Элонгация – элонгациялы ақуызды факторлармен бақыланады. Терминация – РНҚ транскриптат синтезімен бітеді. Стоп-кодонға терминациялы ақуызды фактор қосылады. Бұл кезде транскриптаттың 3^/ - соңына 100-200 аденил қышқыл қалдықтары қлсылып поли А- құйрық түзеді. Поли А – құйрық РНҚ транскриптаттың деградациядан қорғайды және оның цитоплазмаға тасымалдануына жеңілдік жасайды. Бірінші РНҚ транскриптат нуклеоплазмада сақталынуы мүмкін немесе сплайсингке ұшырайды.

Ген – бұл күрделі функциональді  белсенді бірлік, РНҚ молекуласының  синтезін реттеуге белгіленген.

РНҚ сплайсингі.

Бірінші РНҚ транскриптат бөліктерге гетерогенді ядролы нуклеопротеинді  бөлік қосылады, бұл процесс гя-РНП-бөлк деп аталынады.

Оларда РНҚ ұзындығы 5000 нуклеотидтерге дейін және ақуызды  остьке оратылған. Гетерогенді РНП  – бөліктері экзондар мен интрондарға  қосылып, содан кейін жұптарымен байланысып агрегатты немесе сплайсосом түзіледі. Сплайсосом құрамына аз ядролы РНҚ кіреді. Қызметі интрондарды  үзу. Интрондардың үзілуі жоғары дәлділікпен жүреді. РНҚ сплайсинг процессінде спецификалы лассо-тәрізді құрылым түзіледі. Олар интрондарды босатып экзондарды тігеді. Процессинг және сплайсинг РНҚ транскриптат: кэпирлі қайталану, инициация кодоны – метионин, экзондар, стоп-кодон және поли А соңынан тұрады. Мұндай м-РНҚ цитоплазмаға өтіп, белоктың синтез процесіне қолданылады.

Альтернативті сплайсинг. Реттелу  механизмі зерттелінбеген. Альтернативті  сплайсинг мәні, бір ғана бірінші  транскриптаттан әртүрлі м-РНҚ  экзондардың әртүрлі бір ізділігін  тігу арқылы алуға болады.

3. Реттелгіш промоторлар: lac-, trp-, tac-,  pL-  және T7. Олардың сипаттамасы.

Көбінесе мына күшті реттеуші промоторлар қолданылады: E. соli-дің lac- және trp-оперондары; арнайы құрастырылған tac-промотор, ол lас-промотордың 10 аймағын және trp-промоторының 35 аймағынқұрайды; p^L - λ бактериофагының промоторы ; бактериофагтың 10 генінің промоторы Т7. Олардың әрқайсысының сәйкес репрессорлары бар. Ол спецификалық гендердің транскрипциясының өшуін немесе қосылуын реттейді.Сонымен қатар, осы промоторлардың әрқайсысы E. coli  РНК-полимеразасының холо-ферментімен танылады. Ортада лактоза жоқ болса, lас-промотор репрессирленген күйде болады, яғни ол белок-репрессормен өшіріледі. Белок-репрессор lac-оперонының транскрипциясын тежейді. lac-оперонының индукциясы немесе өшірілуі ортаға лактозаны немесе  изопропил-β-D-тиогалактопиранозиданы (ИПТГ) қосқанда жүреді.  lac-промотормен реттелетін транскрипция катаболизм активаторы – белок комегңмен реттеледі (САР). САР  промотормен байланысқанда соңғы өнімнің РНК-полимеразаға байланысуы күшейеді және транскрипция жоғарылайды.  Tac промоторынан транскрипция lac-репрессормен тежеледі де ортаға лактоза немесе ИПТГ қосқанда жоғарылайды. Trp промоторы триптофан—trp-репрессор комплексі әсерінен өшеді. Ол комплекс trp-оператормен байланысып, trp-оперон  танскрипциясын болдырмайды. trp-промотор активациясы ортадан триптофанды алып тастағанда немесе ортаға 3-индолилакрилды қышқылды қосқанда болады. р^L промоторының жұмысы λ бактериофагының cl репрессионды белогы арқылы реттеледі. p^L-промоторынан транскрипцияның реттелуінде с1 репрессордың термосезімтал мутантты формасы —  сI₈₅₇ белогы қолданылады.  Т7 бактериофагы промоторынан транскрипцияның реттелуі үшін сәйкес РНК-полимераза қажет. Бұл промоторды қолдану үшін Т7 фагының РНК-полимераза генін E. coli хромосомасына орналастырады. Ол λ профагы құрамында және lac-промоторының бақылауында. Сосын клеткаларды плазмидамен трансформирлейді. Ортаға  ИПТГ қосады. Клондалған гендердің транскрипциясы мен трансляциясы жүреді. Прокариоттар гендері жұмыс істеуінің немесе экспрессиясының механизмі бүгінгі күні жақсы зерттелген және Е. СоІі бактериясы мен кейбір оның фагтарын көпжылдық іргелі молекулалық-биологиялық зерттеулер арқасында түсінікті бола бастады. Алдымен, прокариоттық геннің экспрессиясы деп осы генде иРНҚ синтезделуін (транскрипция кезеңі) және иРНҚ-ның рибосомадағы трансляциясын (белок синтезін) түсінетінін еске түсірейік.Белок синтезінің бірінші кезеңі — трапскрипцияның инициация процесінде РНҚ-полимераза ферменті промотор деп аталатын ДНҚ-ның ерекше бөлігін тануы керек, тек сонда ғана ДНҚ-ның қос тізбегі ажырап, иРНҚ синтсзделуі бастала алады. Демек, адам немесе жануар генінің бактерия клеткасында жұмыс істеп, қажет биотехнологиялық өнім (белок) түзуі үшін, ең алдымен, оның алдында бактериялық РНҚ-полимераза байланыса алатын прокариоттық күшті промотор болуы керек.Транскрипцияның жоғары деңгейі плазмидалық репликацияның тұрақсыздығына әкелетін атап өту керек. РНҚ-ның ғана емес, әсіресе көптеген белоктардың мөлшерден тыс синтезделуі клетканың жойылуына әкелуі мүмкін. Осындай жағдай болмас үшін пәрменді транскрипцияланатын геннің  соңында трапскрипцияны тиімді терминациялайтын (тежейтін) нүктелер болуы керек. Практикалық мақсат үшін реттелетін транскрипцияны қолдану ыңғайлы.Ген инженериясында бірнеше күшті промоторлар белгілі: Е. СоІі оперондарының промоторлары — LacUY5 (лактоза), trp (триптофан) және гибридтік промотор tас (trp — Lас); лямбда фаг промоторлары — Р_R мен Р_L; т 5, т 7, Х 174 және т. б. фагтардың промоторлары. (22-сұрақ).

4. Гендік инженерияның пайда болуының алғы шарттары. Рекомбинантты ДНҚ-ны клондаудың жалпы бейнесі

. Ген инженериясы молекулалық биологияның жаңа саласы. Ол лабораториялық әдіс арқылы генетикалық жүйелер мен тұқымы өзгерген организмдерді алу жолын қарастырады. Ген инженериясының пайда болуы генетиканың, биохимияның, микробиологияның және молекулалалық биологияның жетістіктерімен байланысты. Бұл атаудың екі түрі қол-данылады: "генетикалық инженерия" және "ген инженериясы". Соңғы кезде "генетикалық инженерия" жалпылама түрде колданылып жүр, ген. Генетикалық инженерияның негізгі мағынасы болып рекомбинантты ДНҚ системасын құрастыру міндеті саналады. Рекомбинатты ДНҚ деп in vitro жағдайында шығу көзі бойынша әр түрлі кез келген екі немесе бірнеше ДНҚ фрагменттерін біріктіру арқылы түзілген ДНҚ-ны түсінеді. Рекомбинантты ДНҚ-ның қарапайым құрамы бөтен ДНҚ мен вектордан тұрады.Генетикалық инженерияның формалды тұрғыдан дүниеге келген уақыты 1972 ж. деп есептеледі, осы жылы II. Бэрг алғаш рет пробиркада үш түрлі микроорганизмдердің — маймылдың рак вирусының, фагтың және бактериялық плазмиданың (вектордың)— ДНҚ  фрагменттерінен бірінші  рекомбинантты ДНҚ молекуласын  құрастырды. Дегенмен, бұл ДНҚ-ның клеткада жұмыс   істей алатындығы тексерілмеді, өйткені құрамында рак  вирусының гені болғандықтан П. Бэрг тәуекелге бармады. Дәл осы кезде Рекомбинантты ДНҚ құрастырудың ең кең таралған әдісі рестриктазаларды қолдануға сүйенеді. Ол жабысқақ ұштар әдісі деп аталады.Бұл әдісте рекомбинантты ДНҚ құрастыру Коэн-Бойер үлгісі бойынша іске асады. Ген де (бөтен ДНҚ үзіндісі де) және векторда бір рестрикциялық ферменттің көмегімен үзіледі, нәтижесінде олардың ұштары бір-біріне  комплементарлы, яғни жабысқақ болғандықтан гибридтік (немесе химерлі) ДНҚ молекуласына ДНҚ лигаза ферментінің көмегімен оңай бірігеді. 'Жабысқақ ұштар әдісі өзі танитын ДНҚ бөлігін симметрия өсінен біршама қашықтықта үзетіп рестриктазаларға сүйенеді. Рекомбинантты ДНҚ-ны жабысқақ ұштар әдісі бойынша құрастырудың жақсы жақтары және кемшіліктері бар. Алынған гибридтік ДНҚ тізбегінде рестриктаза тани алатын   бөліктердің қалпына келуі әдістің   жақсы жағын сипаттайды.Бұл бөтен ДНҚ фрагментін осы  рестриктазаның    әсерімен  салыстырмалы оңай бөліп алуға  мүмкіндік береді. Ал, рестриктаза арқылы алынған барлық тізбектердің – жабысқақ ұштардың бір-бірімен (гомологты тізбектер) реассоцияланып (қайтадан бірігуі) кетуі әдістің кемшілігін көрсетеді. Осының нәтижесінде векторлық молекулалардың бірқатар бөлігі ендірмелермен емес, өз ұштарымен тікелей әрекеттесуі арқасында қалпына келеді, ал басқа векторлар болса бірнеше біріккен бөтен ДНҚ молекулаларынан құралған ендірмелермен қосылып кетуі мүмкін. Сондықтан бір ғана ендірмесі бар гибридтік векторларды іріктеу жұмысын асыру керек.Рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастырудың ыңғайлы әдісі — доғал ұштарды жалғау (тігу). Оның, негізіне Т4 фагынан бөлінген ДНҚ-лигаза ферментінің доғал ұшты екі ДНҚ молекуласын жалғау қабілеттілігі жатады. Бұл әдістің артықшылығы оның кез келген соңғы нуклеотидтер тізбегін жалғай алатындығынан тұрады. Егер белгілі екі тізбекті араларына ендірмеусіз жалғау керек болса, онда бұл әдісті пайдалану өте ыңғайлы.Ген клонын көбейту. Белгілі концентрациялы бактериялық суспензияны қатты ет-пептондық қоректік ортаға, мысалы, қосымша қоректік заттар бар агарга егеді, сонда Петри шыны ыдысының 1см² бетіне 1—10 бактериялар келуі керек. Агардың үстіне түскен бактериялық клеткалар бөліне бастайды, соңында олардың әрқайсысының көптеген ұрпақтары сыртқы пішіні бойынша саңырауқұлақтың қалпақшасына ұқсас кішігірім шоғырлар түзейді. Әр шоғырда бастапқы бір бактериялық клеткадан түзілген және одан ешқандай айнымайтын көптеген клеткалар бар, оны клон деп атайды. Бастапқы суспензияның әрбір клеткасы да өз клонын түзейді (позитивтік колония)Вектор ретінде бактериофагты қолданғанда генді бактерияға енгізу және соңғыны қоректік ортада өсіру жоғарыдағыдай  плазмидалық вектор қолданғандағыдай өтеді.Фаг ДНҚ-сы (енбеген  клеткалар агарда көбейіп, көмескі тегіс «газон» түзейді.   Ал, фаг ДНҚ-ы бар   бактериялар түскен орындарда мөлдір дөңгелек ойыстар түзіледі, оларды негативтік шоғыр деп атайды. Негативтік   шоғырдың түзілуі клеткада фаг ДНҚ-ның репликациялануына және жетілген  фагтардың пайда болуына   байланысты. Бұдан кейін фагтар басқа клеткаларға еніп, оларлы ыдыратады, нәтижесінде әрбір ойын бір ғана ДНҚ-сы клеткаға енген  ДНҚ-ның   копиясы бар фаг ұрпақтарынан тұрады. М13 фагы клетканы лизиске әкелмегендіктен негативтік шоғыр түзбейді. Бірақ олар көбейген орындарда бактериялық клетканың  бөлінуі бәсеңдейді, сондықтан жалпы көмескі  газонда мөлдірлеу ойыстар пайда болады. Соңғы  газонда қажет рДНҚ молекулалары енген     бактериофагтардың көбеюі өтеді.Комплементарлы ДНҚ (кДНҚ) клонын көбейту әдісін организмнің қайсы клеткаларында кажет белок синтезделетінін білгенде ғана алуға болады. Оның үстіне белоктың синтезделуі анағұрлым көп мөлшерде өтуі керек, тек сонда ғана клеткада қажет белоктың иРНҚ-ның көшірмелері көп болады және осыған сәйкес көптеген негативтік шоғырларда іздеп отырған геннің 0 көшірмелері бар деп есептелінеді.Кері транскрипцияның ашылуы құрылымды гендердің жинағын құрастыруға мүмкіндік берді. Оларды гендерге сәйкестендіріп комплементарлы ДНҚ генотекасы деп атайды, өйткені кДНҚ ешуақытта қажет генге толық сәйкес келмейді, сонымен қатар онда қосымша тізбектер де бар.Белгілі бір организмнің толық геномы клонын көбейту үшін қажет гендер жинағының мөлшерін   геномның-молекулалық массасы-(М)  мен фрагменттің орта мөлшерін біліп және   дәлдік деңгейді (Р) таңдап,   анықтауға болады: N =M (n x 1n) -1-P.Қоянның барлық геномын сипаттайтын гендер жинағын құрастыру үшін жоғары дәлдік деңгейде 920 мың клондар қажет. Ген инженериясының классикалық объектісі — Е. Соlі бактериясының гендер жинағын дайындау үшін анағұрлым аз клондар саны қажет-1,4 мың. Сүтқоректілердің геномы үшін ең долбарлы есеп бойынша 800 мың—1 млн. клондар санынан құралған гендер жинағы қажет.

5. Гендік инженерияда кеңінен қолданылатын ферменттер және олардың сипаттамасы.

Ғалымдар репликация процесі  ферменттердің күшімен катализденуі тиіс деген болжам жасады. Сол себепті  организмдерден ферменттерді іздеу  басталды. Бұл жұмыс 1955 ж АҚШ-та Корнберг басшылығымен табысты аяқталды. Ферментті  ішек таяқшасының клеткаларынан  бөліп оны ДНҚ-полимераза деп  атады. 500 мг ферментті алу үшін 100 кг клеткалар керек болды. 1 клеткада ферменттің 400 молекуласы табылды. ДНК  репликациясында ең басты рольді ДНК-полимераза ферменті атқарады. Одан басқа ДНҚ синтезі хеликаза, праймаза, ДНҚ-лигаза, топоизомераза т.б. Ферменттердің  қатысуымен өтеді. ДНҚ синтезінің механизміне  келсек, бұл процесс қос тізбектің  белгілі бір бөлікте ажырап, репликациялық  айыр құрылуынан басталады. Бұл процесске  ерекше хеликаза ферменті қатысады. Эукариоттар  мен көптеген бактерияларда осы  ферменттердің әсерінен ДНҚ молекуласының  матрицалық қос оралымы жоғары және төмен екі бағытта ажыратылады. ДНҚ ажырағаннан кейін де ДНҚ-полимераза ферменті жаңа тізбек синтездей алмайды, өйткені ДНҚ құрылымының өзінде топологиялық қиындықтар бар. Ол ДНҚ-ның  оралу дәрежесіне байланысты. Бұл  қиындық топоизомераза ферменттерінің әсері арқылы шешіледі:оралманың  ілінген тізбектерін үзіп ажыратады  да, репликациялық айырдағы қысымды  төмендетеді. Одан әрі ДНҚ-полимераза ферментінің әрекетіне  қолайлы  жағдай туады. ДНҚ-лигаза — қос тізбекті ДНҚ-ның біреуі үзіліп қалғанда фосфодиэфир  байланысын қалыптастырып, үзілген  жерді "тігетін" фермент. Артта  қалған тізбектің синтезделуінің тағы бір ерекшілігі – ДНҚ-полимераза ІІІ ферменті арқылы түзілетін жаңа ДНҚ тізбегі әрбіреуінің ұзындығы 1000-2000 нуклиотидке тең қысқа тізбектерден тұрады. Оларды тұңғыш байқаған жапон  ғалымның құрметіне 1968 жылы Оказаки  фрагменттері деп атайды.  „Артта қалған“ тізбек синтезін қоздыру  үшін ең алдымен РНҚ-ның қысқа  фрагменті қажет. „Артта қалған“  тізбек синтезін қоздыру үшін ең алдымен  РНҚ-ның қысқа фрагменті қажет. Ал олардың синтезделуін праймаза ферменті (РНҚ-полимераза ферментінен өзгешілігі – молекулалық массасы әлдеқайда  төмен және транскрипция процесіне  тікелей қатыспайды) қамтамасыз етеді

Онымен  генндік инженерияға қажет ферменттер:

• ДНҚ полимераза
• Т7 бактерияфактың ДНҚ лигазаның коферменті
• Полинулеатидкиназа 5^’ сонын фозфорлайды
• Терминалды  трансфераза ферменті ДНҚ 3’ сонына қосымша нуклеотидті н/е нуклеотидтерді қосуға мүмкіндік  береді. Бұл 3’ соңын радиактивті таңбалауғада қолданылады.
• Рекстрикциялық эндануклеазалар жабысқа және түзу соңды кесінділерге кеседі. 3 топқа бөлінеді. 2 шісін ғана пайдалынады.

6. Рестрикциялық эндонуклеазалар.  Олардың классификациясы.

 Рестриктазалар (рестрикциялық эндонуклеаза) –қайшының рөлін атқарады.  ГИ д үниеге келуінің себепкері. Бактериофагты шектейді, ДНҚ-дағы сайтты таниды. Жабысқақ немесе түзу соңды кесінділерді береді. Ұз-ғы 4-8 ж.н. Полинтрон болуы мүмкін. Полинторн-5’соңынан санағанда бірдей оқылатын қос тізбекті ДНҚ. Белгілі бір ДНҚ молекуласындағы нуклеотид сандарын таниды (рестрикциялық сайттар).1953 жылы Е.Coli штамын басқа бір клеткалар штамына енгізгенде,ДНҚ-ға ұқсас фрагменттерге бөлінетіндігі анықталған.1966 жылы қожайын клеткалар ДНҚ-сы бірнеше митилдік негізден тұратындығы анықталды. Ол тек модификацияланған қожайын клеткада ғана,ал модификацияланбаған ДНҚ ол жоқ,тек репликация аяқталғаннан кейін ғана негізгі метилдік топ қосылады. Бактериялар өзінің модификация типіне байланысты өзінің ДНҚ-сын ажырата алады. Оған ДНҚ-метилаза ферменті жауап береді. Бөгде ДНҚ рестрикциялық ферменттер қозғалысына сезімтал етедРестрикциялық ферменттер сәйкес сайттарда метил тобының жоқ екенін таниды. 1968 жылы Мезельсон мен Юань рестриктазаны бөліп алды.1970 жылы Смит пен Вильконс Haemophilus infuenzae-дан бірінші рестриктазаны алды. Ол қатаң түрде белгілі ДНҚ тізбегін ыдыратты. Себебі әр түрлі бактериялар өзінің ДНҚ-сын әр түрлі белгілейді. Содан бері 150 рестрикциялық сайттарды танитын рестриктазалар бөлініп алынды. 1 класты рестриктазалар. Көбінесе зерттелген 1 кластағы рестриктазаға  E.coli К12 және  E.coli В клеткаларынан бөлінген ЕсоК және ЕсоВ ферменттері жатады. Бұл ферменттердің молекулалық массасы 135, 60,50кДа. Бұл кластағы рестриктазалар модифицирленбеген қостізбекті ДНҚ-ға арналған және төмендегі қасиеттерге ие: 1) кофактор ретінде АТФ,  S-аденозинмонофосфат, магний ионын қолданады; 2)ДНҚ-ның кесілуі АТФ гидролизімен қатар жүреді. 2 класты рестриктазалар. Бұл класс жүйесі оқшауланған рестрикционды эндонуклеаза белоктарынан және модификационды метилазадан тұрады. Сондықтан да бұл кластағы рестриктазаларды метилазалық активтіліктен бос күйінде бөліп алуға болады. Қызметі: модифицирленбеген қостізбекті ДНҚ молекуласын танып, оны кеседі. Ол үшін физиологиялық конц-ғы магний ионы қажет. 3 класты рестриктазалар 1 класты рестриктазалармен сәйкестігі бар. Натифті фермент 2 түрлі суббірліктен тұрады және бифункционалды, сонымен қатар, рестриктазды және метилазалық активтілікке ие. Бұл класс рестриктазалары ұзындығы 5-6 пн симметриялық емес тізбекті  таниды және тану аймағынан 24-27 пн арақашықтықта ДНҚ-ны кеседі.  Ол үшін АТФ жән магний ионы қажет.

7. ДНҚ полимераза. Оның құрылыс ерекшеліктері және негізгі қасиеттері.