Характеристика нейроиммунного взаимодействия у больных ревматоидным артритом

Определение гранулоцитарного и моноцитарного фагоцитоза проводилось на проточном цитофлюориметре фирмы Becton Discinson (США). Инкубировали выделенные на градиенте плотности фиколл-верографин (1,082 г/см³) мононуклеары и лейковзвесь клеток, полученную после добавления 10% р-р желатина (до 1% концентрации) к гепаринезированной периферической крови, с 10 мкл латекса, нагруженного гамма глобулином (Биопрепарат, Санкт-Петербург), меченным ФИТЦ. Иммуноцитометрию проводили с использованием параметров светорассеяния (FSC и SSC) для выделения областей моноцитов и гранулоцитов, из которых строили гистограммы (Кожевников В.С., 1998).

Определение уровня иммуноглобулинов классов G,A,M (IgG,A,M)в сыворотке крови проводилось турбодиметрическим методом c использованием наборов реагентов для микроанализа производства ЗАО НПО «СИНТЕКО» (г. Москва ) согласно инструкции по применению.

Оценка уровня циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) проводилось фотометрическим методом по Настаушевой Т.Л. (адаптация метода для нефелометра Трунова А.Н.,1997).Тест базируется на преципитации ЦИК в 3% и 4% ПЭГ (6000). Частное от деления показателей о.п. растворов с 4% на о.п. 3% ПЭГ позволяет судить об относительной молекулярной массе (О.м.м.ЦИК) комплексов, при этом показатель £ 1,1 свидетельствует о преобладании крупномолекулярных;>1,1£1,5 – среднемолекулярных; >1,5 – о низкомолекулярных комплексах.

Определение фаз клеточного цикла и апоптоза в популяциях CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов (Philpott N.J., et al. 1996; Nicoletti I. et al.1991; Fruenauf S., et al. 1998) проводили на проточном цитометре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы СellQuest^Pro (Becton Dickinson, США). Относительное содержание клеток с гипердиплоидным (клетки в S-M фазах клеточного цикла) и с гиподиплоидным (апоптотические клетки) набором ДНК определяли по степени флуоресценции внутриядерного красителя 7-AAD. Результаты выражали в виде процентного соотношения позитивных клеток к общему количеству лимфоцитов (не менее 10000).

Определение внутриклеточных  цитокинов в субпопуляциях Т-лимфоцитов. Относительное количество цитокин-продуцирующих (CD4⁺, CD8⁺ (IFNγ⁺, IL-4⁺, IFNγ⁺/IL-4⁺) клеток определяли методом трехцветной проточной цитометрии. Анализировали на цитометре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы СellQuest^Pro (Becton Dickinson) (Maino V.C., 1998).

Определение влияния ацетилхолина йодида (1×10^-7М) и адреналина гидрохлорида (1×10^-7М) на клеточный цикл и апоптоз CD4⁺ и CD8⁺лимфоцитов. Стерильно выделенные мононуклеары (1·10⁶клеток на лунку) культивировали в течение 24 часов с ацетилхолином йодидом (1×10^-7М) и адреналином гидрохлоридом (1×10^-7М) относительно контроля в полной культуральной среде при 37°С. Затем клетки собирали, отмывали и в каждой пробе определяли процент клеток, находящихся в разных фазах клеточного цикла и апоптоза с предварительным фенотипированием CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов. Проводили фиксацию, пермебиализацию, инкубировали с РНК-азой в дозе 20 мкг/мл, после которой проводили фиксацию 5% формалином, содержащим 7-актиноаминомицинД (7-ААД). Образцы анализировали на проточном цитофлюориметре.

Определение влияния ацетилхолина йодида и адреналина гидрохлорида на содержание внутриклеточных  цитокинов в субпопуляциях CD4⁺, CD8⁺ лимфоцитов. Мононуклеарные клетки выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина (r= 1,082 г/см³). Затем МНК ресуспендировали в среде RPMI-1640, содержащей 10% FCS, 5мМ L-глутамин, 10мМ Hepes. Ресуспендированные клетки переносили в лунки 24-луночного культурального планшета (Falcon, Becton Dickinson, США) в концентрации 10⁶клеток на лунку и культивировали в течение 4 часов в присутствии стимулятора РМА (30 нгр/мл), кальциевого ионофора иономицина (1 мкгр/мл) и ингибитора белковой секреции брефелдина А (10мкгр/мл), а также  ацетилхолина йодида (1×10^-10 и 1×10^-7М) и адреналина гидрохлорида (1×10^-7 и 1×10^-4М) против аналогичных проб контроля, не содержащих ацетилхолин и адреналин, при 37°С в атмосфере 5% СО_2. Определение содержания внутриклеточных цитокинов в CD4⁺, CD8⁺ лимфоцитах проводили на цитометре.

Измерение длины теломерных участков ДНК в  Т- лимфоцитах Лейкоциты (1×10⁶) смешивали с 5×10⁵ спленоцитов мыши и осаждали. Осадок ресуспендировали в 300 мкл гибридизационного раствора, содержащего 70% формамида. Флуоресцеин (СССТАА)₃ Peptide Nucleic Acid (PNA) зонд добавляли в концентрации 0,3 мкг/мл. Инкубировали при 80˚С в течение 10 минут, гибридизация длилась 3 часа. По окончании гибридизации клетки переносили в пробирки для цитометрии, дважды отмывали 70% формамидом и однократно ЗФР-БСА, содержащим 0,1% Tween 20. Осадок ресуспендировали в 0,5 мл ЗФР-БСА, содержащим 25 мкл/мл РНКазы и 7-аминоактиномицина. Анализ проб проводили на проточном цитофлуориметре FACS Calibur с помощью программного обеспечения Cell Quest ^PRO. Сигнал флуоресценции теломер определяли как средний уровень флуоресценции (MFI) клеток, находящихся G₀/G₁ фазе клеточного цикла, вычитанием фоновой аутофлуоресценции (т.е. MFI контрольных образцов, прошедших FISH в отсутствии PNA зонда). Относительное значение длины теломерных районов ДНК определяли как отношение MFI исследуемого образца к MFI спленоцитов мыши. Дополнительно вводился коэффициент для уравновешивания сигнала на количество хромосом в клетках, т.к. у  человека 46 хромосом, а у мыши 42. Оценка абсолютной длины теломерных участков ДНК проводилась пересчетом через относительную длину по формуле  Y = 2014 + 286×X, где «Y» - это получаемая абсолютная длина в парах нуклеотидов, а «X» - это длина теломерных участков ДНК относительно клеток внутреннего контроля (ОДТ). Формула получена в результате пересчета по 5 донорам относительной длины через абсолютную, измеренную методом Southern Blotting.

Психологические методы

Тестирование  параметров мышления. Использовался краткий ориентировочный тест (КОТ) - адаптированный тест Вандерлика (Анастази А., Урбина С., 2007). Результаты исследования выражались в баллах.

Тестирование  параметров памяти. Для определения параметров кратковременной памяти и реминисценции памяти использовался метод 10 слов. При этом в течение ограниченного времени (30 секунд) обследуемый должен запомнить 10 слов (на карточке), не вызывающих эмоциональных реакций, после изъятия карточки и через 30 секунд мысленного повторения должен их воспроизвести (кратковременная память %). В течение последующих 15 минут обследуемого отвлекают посторонними разговорами, а затем он должен вновь воспроизвести указанные выше 10 слов (реминисценция памяти %) (Лурия А.Р., 1973).

Тестирование  типологических особенностей нервной системы. Использовалась экспертная психологическая программа группы авторов под руководством профессора Б.Я. Первомайского (программное обеспечение Т.И. Клейн) (МСП «Катарсис». Психологический центр, Луганск, 1992). Указанная программа разработана на основе индивидуальных опросников, представляющих собой модифицированную версию опросников Strelau, Terelak (Strelau, Terelak, 1974), Paisey, Mangan (Paisey, Mangan, 1987). Она позволяет определить силу, подвижность и инертность возбудительных и тормозных процессов с математическим выражением полученных показателей. Результаты выражались в условных единицах (у.е)

Тестирование функциональной межполушарной асимметрии мозга по четырем парным функциям проводилось с помощью опросного метода и функциональных проб (Брагина Н.И., Доброхотова Т.А., 1988; Леутин В.П., Николаева Е.И., 1988). При этом в моторной сфере выявлялось функциональное предпочтение руки и ноги. Асимметрия в сенсорной сфере выявлялась в преимуществе одного глаза в бинокулярном акте зрения, а также в преимуществе уха при слухо-пространственном различении в бинауральном восприятии акустических сигналов. Асимметрия зрения, слуха, рук и ног определялась по преобладанию правых или левых значений проб, в каждом случае использовалось не менее 10 проб. Если сумма левых показателей равнялась сумме правых и были случаи равенства по одному из показателей, то отмечалась симметрия. Обследованные лица разделялись на 3 группы, отличающиеся степенью выраженности признаков право- и леволатеральности. В 1 группу «правшей» были отнесены люди абсолютно праволатеральные по четырем парным функциям. Группа амбидекстров включала всех остальных женщин с различной степенью выраженности в обоих полушариях право- левосторонних и симметричных показателей: группа 2 - амбидекстры с одним латерализованным слева или симметричным признаком (амбидекстры 1) и группа 3 - амбидекстры с двумя и более латерализованными слева или симметричными признаками (амбидекстры 2).

Методы  функциональной диагностики. Определение активности отделов вегетативной нервной системы (ВНС) проводилось методом кардиоинтервалографии - оценки вариабельности сердечного ритма (ВРС). Частоту сердечных сокращений и измерение длительности R-R интервалов производили с помощью электрокардиографического комплекса «KARDi» (г.Зелиноград, Россия). Записывали 150 R-R интервалов в состоянии полного покоя обследуемого, 150 – во время проведения пробы с ментальной нагрузкой (устный счет) и 150 – на фоне проведения дыхательной пробы с фиксированной частотой дыхания (8 раз в минуту). Показатели ВРС рассчитывались во временной и частотной областях. На основании описанных параметров вариационной пульсометрии вычисляли интегративные показатели – индексы проф. Р.М. Баевского (А.М. Вейн с соавт, 2003). Методика анализа полученных данных и их физиологическая интерпретация были приведены в соответствие с соглашением, достигнутым Европейским обществом кардиологов и Северо-Американским обществом по электростимуляции и электрофизиологии (1996 г.).

Статистическая  обработка данных. Для математической обработки полученных данных использовалась статистическая компьютерная программа STATISTICA 6.0 for Windows (StatSoft, USA). При сравнении 2 средних величин количественных показателей использовались параметрические (t-критерий Стьюдента для независимых и зависимых групп) и непараметрические методы (Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса). Для сравнения трех независимых групп применялся параметрический дисперсионный анализ (Breakdown and one-way ANOVA) и непараметрические методы сравнения (Краскела-Уолисса, медианный тест)  согласно условиям применения данных статистических процедур (Реброва О.Ю., 2003). Сравнение групп по качественным признакам проводилась с использованием точного критерия Фишера. Для таблиц 2х2 использовался критерий проверки гипотез МакНемара. При оценке ранговой корреляции применялся непараметрический метод Спирмена. Различия между группами оценивались как значимые при p≤0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ  СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

На начальном этапе анализа полученных результатов было установлено сочетанное изменение психологических (типологические свойства нервной системы, показатели памяти и «общих способностей»), иммунологических и функциональных параметров больных РА относительно здоровых женщин аналогичного возраста. В частности, больных характеризовало значимое снижение силы нервных процессов (р=0,001), силы возбуждения (р=0,003), подвижности возбуждения (р=0,001), общих способностей (р=0,001), кратковременной (р=0,001) и долговременной памяти (р=0,001), при этом, больным была свойственны   повышенная  активность первой сигнальной системы (р=0,02) и высокая инертность торможения нервной системы (р=0,001). Известно, что типологические свойства нервной системы, в частности, сила нервных процессов связана с эмоциональной сферой и вегетативной нервной системой (ВНС). Так, слабую нервную систему характеризует высокая концентрация адреналина, АКТГ и кортизола с увеличением выработки адреналина над норадреналином. В то же время, адреналин - гормон тревоги, а тревожность выше у лиц со слабой нервной системой (Ильин Е.П., 2004).

Состояние ВНС группы больных РА относительно здоровых свидетельствовало о переходе регуляции сердечного ритма (СР) с автономного на центральный контур управления и истощении мощности спектра за счет двух из трех ее составляющих (WLF, LF) в покое и при нагрузках на симпатический (СО) и парасимпатический (ПО) отделы.     

Результаты сравнения  иммунологических показателей больных РА и здоровых доноров согласовывались с литературными данными (Быковская С.Н., Насонов Е.Л.,2005; Moudgil KD, e.a., 2011; Herman S, e.a. 2011; Munoz-Suano A, e.a. 2011) и свидетельствовали о нарушении субпопуляционного состава Т-клеточного звена иммунной системы, количественной и функциональной активации В-лимфоцитов, а также о значимых изменениях моноцитарно-макрофагального звена иммунной системы и снижении содержания НК-клеток (CD16⁺) (таблица 1). Результаты анализа не только подтверждали известные ранее при РА нарушения  иммунной системы, но и впервые выявили значимые изменения нервной системы на уровне параметров высшей нервной деятельности (ВНД), темперамента и активности отделов ВНС.

                                                                                                                                                                                 Таблица1

Иммунологические  показатели у больных РА и здоровых женщин                                                                                                                                                                                

Примечание: M±SD – средняя ± стандартное отклонение; р1 – t критерий Стьюдента; р2 – критерий Манн-Уитни; ИРИ – иммунорегуляторный индекс; ЦИК – циркулирующие иммунные комплексы; ПАН – показатель активации нейтрофилов; ПАМ – показатель активации моноцитов;