Характеристика нейроиммунного взаимодействия у больных ревматоидным артритом

Известно, что  активация лимфоцитов является необходимым условием иммунного ответа,  процессом, на котором базируются практически все иммунологические реакции. Одним из самых ранних маркеров активации, определяющих направление  внутриклеточной сигнализации,  является экспрессия корецептора Т- клеток CD28 (Andrew P. Fontenot, Laia Ghavari, Sean R. Bennet et al.2003). При исследовании содержания CD4⁺ и CD8⁺ - лимфоцитов, несущих маркеры активации,  у пациентов больных РА с различной церебральной асимметрией установлены значимые различия между первой и третьей группами. При этом, для пациентов третьей группы характерно увеличение содержания CD8⁺ - Т - лимфоцитов, экспрессирующих ранний маркер активации CD28 (р=0,03) без повышения экспрессии поздних маркеров, поскольку в этой группе установлено относительное повышение содержания клеток, негативных по содержанию CD25⁺- лимфоцитов (р=0,044).  При сравнении групп пациентов  относительно здоровых женщин с аналогичной ФМА установлено значимое повышение содержания CD4⁺25⁺ лимфоцитов в первой группе пациентов и снижения CD3⁺4^-8⁺ лимфоцитов в третьей группе больных РА (таблица 4). Дефицит CD8⁺ лимфоцитов в 3 группе, возможно, связан с установленным нарушением экспрессии поздних маркеров.

Вторая  группа больных относительно здоровых женщин с аналогичной ФМА, характеризовалась значимыми различиями как CD4⁺, так и CD8⁺ лимфоцитов. При этом, в популяции CD4⁺ установлено повышение лимфоцитов, не несущих маркеры активации и значимое снижение клеток, экспрессирующих DR - молекулу, в то время как в популяции CD8⁺ -лимфоцитов выявлен дефицит как активированный, так и неактивированных Т – лимфоцитов.

                                                                                                                                    Таблица 4

Активационные маркеры Т-лимфоцитов больных РА и здоровых женщин в зависимости от ФМА

Параметры лимфоцитов	Группы ФМА	Больные РА	Здоровые	р
CD4+25-     (%)	Группа 1 («правши»)	27,8±3	35,4±2,1	0,07
CD4+25+   (%)		35,9±2,9	25,1±2,2	0,019
CD3+4+8-   (%)	Группа 2 («амбидекстры1»)	65,4±5,8	50,0±3,2	0,05
CD4+DR-  (%)		59,8±3,4	41,4±5	0,006
CD4+DR+  (%)		4,01±1,06	10,9±2,4	0,006
CD3+4-8+   (%)		27,2±4,9	40,7±2,2	0,039
CD8+DR+ (%)		5,4±0,9	13,2±3,6	0,011
CD8+28+ (%)		13,7±2,7	26,3±2,05	0,003
CD8+25-  (%)		34,07±3,4	43,7±2,8	0,08
CD3+4+8- (%)	Группа 3 («амбидекстры2»)	66,3±5,9	54,0±3,8	0,09
CD3+4-8+ (%)		24,3±4,2	35,8±3,4	0,049

Примечания: M±m;

Учитывая ключевую роль Т- лимфоцитов в патогенезе аутоиммунного  заболевания на следующем этапе  работы исследовались  параметры  пролиферации, определенной по фазам клеточного цикла и апоптоза различных субпопуляций CD4⁺ и CD8⁺ лимфоцитов больных РА с различной ФМА (таблица 5). Было установлено самое низкое содержание CD4⁺ клеток памяти (CD4⁺CD45RO⁺) и самый высокий уровень апоптоза указанной популяции клеток в третьей группе пациентов с преимущественно доминантным правым полушарием относительно других групп больных.

Таблица 5

 Параметры  фаз клеточного цикла и апоптоза больных РА с различной ФМА

Параметры (%)	Группа1(n=15)	Группа2(n=19)	Группа3(n=15)	Р
CD4+CD45RO+	24,4±1,9	21,5±1,9	17,6±2,05	0,019(1-3)
CD4+CD45RO+apop	0,048±0,02	0,046±0,02	0,16±0,05	0,03(1-3) 0,032(2-3)
CD4+CD45RA+apop	0,026±0,01	0,068±0,04	0,13±0,06	0,08(1-3)
CD8+apop	0,37±0,14	0,196±0,09	0,079±0,03	0,05(1-3)
CD8+CD45RA+	15,4±1,7	18,2±2,3	20,8±1,7	0,047(1-3)
CD8+CD45RAG1G0	96,5±1,15	98,13±0,26	98,18±0,3	0,08(1-3)
CD8+CD45RA(SM)	3,3±1,04	1,85±0,27	1,76±0,32	0,09(1-3)

Примечание: M±m;

В то же время, первая группа пациентов с доминантным левым полушарием, имела самое низкое содержание «наивных» CD8⁺CD45RA⁺ лимфоцитов и самый высокий уровень апоптоза во всей CD8⁺ популяции лимфоцитов.

В отличие от групп здоровых с аналогичной  доминантностью (таблица 6), в первой группе  выявился дефицит CD8⁺ и тенденция к активации CD4⁺, а в третьей группе - к снижению CD4⁺ клеток «памяти» и тенденция к активации CD8⁺ «наивных» Т- лимфоцитов. Для второй группы больных РА было характерно умеренное снижение CD8⁺CD45RO⁺  и значимое снижение апоптоза CD8⁺CD45RA⁺ - популяции Т- клеток.

Статистически значимых различий по показателям клеточного цикла и апоптоза между группами здоровых женщин с различной ФМА,  обнаружено не было. Тем не менее, как и у больных РА (на уровне тенденции) в 1 группе здоровых женщин выявлено повышение содержания CD8⁺CD45RA⁺ в SM фазе и соответствующее снижение клеток в G₁G₀ фазе клеточного цикла. При сравнении показателей фаз клеточного цикла и апоптоза  больных РА относительно здоровых женщин выявлено не зависящее от функциональной асимметрии снижение CD8⁺CD45RO⁺ лимфоцитов во всех исследуемых группах (таблица 6). Указанное снижение возможно обусловлено высокой плотностью β2-адренорецепторов на данной популяции клеток у лиц со стрессом, вызванным системной патологией (Elenkov Ilia J.,e.a. 2000). Степень дефицита CD8⁺CD45RO⁺ лимфоцитов в группах была различной. Так, в группе 1 больных РА было снижено общее содержание CD8⁺ лимфоцитов относительно первой группы здоровых женщин с аналогичной ФМА. Группа 2 больных РА, в отличие от здоровых женщин 2 группы, характеризовалась значимым снижением уровня апоптоза указанной популяции. Третья группа пациенток с преимущественно доминантным правым полушарием, в отличие от здоровых женщин 3 группы, характеризовалась выраженной тенденцией к повышению содержания CD8⁺CD45RA⁺  лимфоцитов.

                                                                                                         Таблица 6

Сравнительная характеристика показателей клеточного цикла и апоптоза у больных  РА и здоровых женщин с различной  ФМА

Параметры (%)	Группы ФМА	Больные РА	Здоровые	Р
CD8+CD45RO+	Группа 1(«правши»)	4,8±0,8	8,1±0,9	0,02
CD8+		20,7±1,6	25,4±1,7	0,055
CD4+CD45RO+		24,4±1,9	20,5±1,2	0,09
CD8+CD45RO+	Группа 2 («амбидекстры1»)	5,8±0,9	8,4±0,3	0,055
CD8+CD45RA+apop		0,04±0,02	0,18±0,03	0,004
CD8+CD45RO+	Группа 3 («амбидекстры2»)	4,3±0,7	8,06±1,2	0,01
CD4+apop		0,088±0,02	0,29±0,1	0,028
CD4+CD45RO+		17,6±2,05	23,5±1,4	0,066
CD8+CD45RA+		20,6±1,7	15,6±1,6	0,067

Примечания: M±m;

Рис 2. Влияние ацетилхолина (1·10-7M) и адреналина (1·10-7M) на содержание CD8+ лимфоцитов, находящихся в SM фазе клеточного цикла в периферической крови здоровых женщин; p=0.036 группа 1 (контроль - ad(1·10-7M);

Поскольку больные РА с различной ФМА значимо различались между собой и здоровыми женщинами не только по параметрам Т- клеточного звена иммунной системы, но и по показателям активности отделов ВНС, на следующем этапе работы определялся характер влияния нейромедиатора ПО ВНС ацетилхолина (1·10^-7M) и нейромедиатора СО ВНС, а также гормона адреналина  (1·10^-7M) на фазы клеточного цикла и апоптоз CD4⁺ и CD8⁺ - лимфоциты больных и здоровых женщин in vitro. Было установлено, что после суточной инкубации в полной культуральной среде (ПКС), лимфоциты здоровых людей без нейромедиаторов (в контроле) и в опыте (с добавлением физиологических концентраций ацетилхолина (ах) или адреналина (ad)) не различались по параметрам апоптоза между группами с различной ФМА. Между указанными группами здоровых людей были определены различия по содержанию CD8⁺ лимфоцитов, находящихся SM фазе, инкубированных с адреналином, в частности,  увеличение показателя в группе 3.

Увеличение, тем  не менее, являлось относительным (рис.2), поскольку при анализе зависимых групп, этот показатель в третьей группе под воздействием адреналина достоверно не изменился, в то время как, в первой группе было установлено снижение относительного содержания CD8+ лимфоцитов в SM фазе под влиянием адреналина.

При определении  характера влияния нейромедиатора и гормона на фазы клеточного цикла и апоптоз Т - лимфоцитов больных РА были установлены значимые различия по показателям апоптоза CD4⁺- лимфоцитов. В частности, в контроле после суточной инкубации клеток в ПКС между группами больных с различной ФМА, в то время как инкубация этой клеточной популяции в присутствии ацетилхолина и адреналина, указанные различия нивелировала  (таблица 7).

Различия по уровню апоптоза CD8⁺ лимфоцитов под влиянием адреналина между первой и третьей группой были установлены на уровне тенденций (0,69±0,3 vs. 0,33±0,11,соответственно; р=0,08), а достоверные различия по уровню апоптоза CD8⁺ лимфоцитов были определены под воздействием ацетилхолина, также с увеличением этого показателя в первой группе относительно третьей (0,52±0,15 vs. 0,25±0,07; р=0,051). В то время как, в контроле уровень апоптоза  CD8⁺ - лимфоцитов между группами больных не имел достоверных различий. Из полученных нами in vitro результатов наибольший интерес вызывает факт повышения уровня апоптоза CD8⁺ клеток под влиянием физиологических доз ацетилхолина у больных РА первой группы и повышения апоптоза CD4⁺ клеток под влиянием ацетилхолина и адреналина без увеличения уровня пролиферативной активности этих клеток у пациентов второй  и  третьей групп. 

                                                                                                                                                                           Таблица 7

Определение характера влияния ацетилхолина и адреналина на уровень апоптоза CD4⁺ лимфоцитов больных РА с различной ФМА

Параметры	Группа 1(n=7)	Группа 2(n=10)	Группа 3(n=12)	Р
CD4+ (к) % апоптоз	0,23±0,05	0,078±0,03	0,048±0,2	0,002  (1-2) 0,0003(1-3)
CD4+ (ax) % апоптоз	0,18±0,08	0,2±0,075	0,12±0,04	>0,05
CD4+ (ad) % апоптоз	0,19±0,06	0,097±0,04	0,16±0,06	>0,05

Примечание: M±m;

  Учитывая количественный и функциональный дефицит CD8⁺ клеток в периферической крови больных РА первой группы, наличие у них относительной парасимпатикотонии, а также преимущественно гуморально-метаболический вариант обеспечения ВНС, количественный и функциональный дефицит CD4⁺ - клеток в крови больных РА третьей группы, полученные результаты могут свидетельствовать о роли нейромедиаторов ВНС в дефиците указанных клеток в этих группах. Отсутствие дефицита CD4⁺ - клеток во 2 группе больных, возможно, обусловлено относительной симпатикотонией и высоким уровнем пролактина (Krishnan N., e.a. 2003).

Известно, что уже на стадии пролиферации начинается дифференцировка Т – клеток, поэтому на следующем этапа анализа  нами была проведена сравнительная характеристика  обеих Т- клеточных субпопуляций в зависимости от содержания внутриклеточных цитокинов, функционально характеризующих указанные популяции как Т - клетки первого (Т1) и Т - клетки второго типа (Т2) у пациентов больных РА и здоровых женщин

                                                                                                                                       Таблица 8

Сравнительный характеристика CD4⁺ и CD8⁺  лимфоцитов в зависимости от содержания внутриклеточных цитокинов  больных РА и здоровых женщин группы 1 («правшей»)

Параметры	Группа1(больныеРА) (n=22)	Группа1(здоровые) (n=16)	P
CD4+/ IFNg+ лимфоциты (%)	18,3±2,6	35,3±3,7	0,0004
CD4+(IFNg/IL-4)+ лимфоциты (%)	2,4±0,5	0,9±0,15	0,017
CD4+/ IL-4 лимфоциты (%)	0,54±0,1	1,75±0,2	0,000014
CD8+ IFNg+ лимфоциты (%)	49,3±2,3	51,8±2,07	>0,05
CD8+(IFNg/IL-4)+ лимфоциты (%)	1,06±0,3	0,49±0,09	0,08
CD8+/ IL-4 лимфоциты (%)	0,55±0,1	2,2±0,7	0,007

 Примечание: M±m;

. Характер различий общей группы больных от здоровых доноров свидетельствовал о снижении как Т1, так и Т2 - лимфоцитов, кроме «наивных» CD4⁺ и CD8⁺ с двойной экспрессией (IFNg/IL-4)⁺, уровень которых был выше в группе больных. Сравнительный анализ Т1 и Т2 лимфоцитов больных РА и здоровых женщин свидетельствовал о противоположных изменениях в группах больных с различной ФМА: о   дефиците Т2 лимфоцитов в первой группе больных и Т1 лимфоцитов в третьей группе (табл. 8, 10).

 Дефицит  Т1 лимфоцитов для пациентов первой группы касался только CD4⁺IFNg⁺ лимфоцитов, в то время как, содержание CD8⁺ IFNg⁺ лимфоцитов  не было снижено. Также содержание  CD8⁺(IFNg/IL-4)⁺ лимфоцитов значимо не различалось с аналогичной группой здоровых, в то же время количество  «наивных» CD4⁺(IFNg/IL-4)⁺ было относительно высоким (таблица 8).  В третьей группе пациентов  Т2 лимфоциты в разной степени различаются от Т2 лимфоцитов здоровых людей: если популяция CD4⁺/IL-4⁺ лимфоцитов значимо снижена, то содержание CD8⁺/ IL-4⁺ - лимфоцитов не отличалось от здоровых.  Повышение CD8⁺(IFNg/IL-4)⁺ лимфоцитов, как и в 1 группе пациентов, на уровне тенденции (таблица 10).