Методы выделения нуклеиновых кислот из биологического материала

Большое прикладное значение имеет возможность  решения методом АСМ задачи физического картирования ДНК: специфические участки макромолекулы помечаются определенными маркерами, анализ местоположения этих маркеров на получаемых АСМ-изображениях позволяет составлять карты относительного расположения специфических последовательностей нуклеотидов. Так, в работе [9] продемонстрирована возможность визуализации местоположения биотина, ковалентно привязанного к первому нуклеотиду праймера. Биотин помечался белковым комплексом стрептавидин-стафиллококковый белок А (стрептавидин имеет высокую способность связывания с биотином, а белок А увеличивает размеры маркера для однозначной его идентификации на АСМ-изображениях).

В работах [34,35] был использован метод картирования клонированных в плазмидный вектор последовательностей LTR (длинные концевые повторы) с помощью специфических маркеров, имеющих характерную форму - R-петель. R-петли формировались последовательностями РНК из 345 и 380 нуклеотидных оснований, комплементарными к U3 и U5 областям LTR человеческого эндогенного ретровируса K-10 (HERV-K10). В процессе образования петли РНК формировала двойную спираль с комплементарным участком ДНК, вытесняя вторую нить ДНК, которая коллапсировала в результате воздействия ионов Mg ²⁺; характерная форма образованной структуры (петля) позволяла уверенной идентифицировать ее на АСМ-изображениях. Различная длина зондов позволяла уже из одной гистограммы определить как положение, так и ориентацию LTR. Полученные результаты позволяют предположить, что в будущем разрешение приборов СЗМ может быть достаточным для определения последовательности нуклеотидов ДНК.

Уникальную  возможность зондового микроскопа как прибора, позволяющего проводить  прецизионные исследования локальных  свойств поверхности, продемонстрировали авторы работы [36]. Они проводили прямые исследования силового взаимодействия, ответственного за формирование витков молекулы ДНК, по следующей схеме.

На  поверхностях подложки и кремниевого  микрозонда создавали два типа покрытия, представляющего собой слой ковалентно привязанных за один из концов комплементарных  олигомеров - в одном случае (АЦТГ)₅, в другом (ЦАГТ)₅. В процессе взаимодействия пары данных олигонуклеотидов (длиной в 20 нуклеотидов) возможно образование комплексов с 20, 16, 12, 8 и 4 парами взаимодействующих оснований.

В ходе эксперимента многократно измеряли кривую силового взаимодействия F(z) между  зондом и подложкой. На основании  этих результатов определяли силу адгезии  и строили гистограммы ее распределения. В случае отсутствия специфического взаимодействия между комплементарными участками наблюдалось бы однородное гауссово распределение для силы адгезии. Однако на полученных гистограммах четко прослеживались отдельные  пики (1,52±0,19; 1,1±0,13; 0,83±0,11 нН), отображающие, очевидно, специфическое взаимодействие 20, 16 и 12 пар комплементарных оснований (авторы указывают, что комплексы с 8 и 4 взаимодействующими парами оснований термодинамически нестабильны при 27^°С - температуре проведения исследований).

Сходную экспериментальную  схему - с образованием между взаимодействующими поверхностями ``мостиков'' в виде отдельных нитей ДНК длиной в 160 оснований - использовали для анализа внутримолекулярных упругих свойств. Таким образом, авторам удалось продемонстрировать возможность применения АСМ для прямого количественного анализа межмолекулярного и внутримолекулярного взаимодействия в комплексах биологических и синтетических макромолекул, что открывает новые перспективы для обнаружения и локализации специфических последовательностей нуклеотидов с ангстремным разрешением.

7 Заключение

В результате изучения цитируемых в этом обзоре литературных источников установлены  приоритетные требования, которые должны обеспечивать методы выделения ДНК  или РНК:

– лизис биологического материала;

– селективную экстракцию (сорбцию);

– концентрирование из больших объемов;

– отделение компонентов, которые  ингибируют ПЦР;

– разделение ДНК и РНК; – высокий  процент выхода;

– возможность калибровки и положительного контроля;

– отсутствие контаминации; – малые  временные затраты;

– возможность автоматизации.

Некоторые автоматизированные приборы с использованием магнитных частиц уже применяются  для подготовки образцов в лабораториях. В Институте аналитического приборостроения  РАН разработан макет автоматического  прибора для выделения ДНК. Метод, положенный в основу данного устройства, получил условное название метода магнитной  ротации. Сепарация частиц из раствора осуществляется на намагниченных стержнях, опущенных в раствор. Отделение  магнитных частиц с сорбированными на их поверхности нуклеиновыми кислотами  происходит после помещения стержней в реакционную смесь и их намагничивания. Перенос магнитных частиц в пробирку со следующим по протоколу реагентом  или раствором осуществляется намагниченными стержнями. После помещения стержней в соответствующую жидкость и размагничивания их вращают для равномерного перемешивания суспензии магнитных частиц и прочих компонентов. Подобный принцип построения устройства позволяет достичь высокого качества очистки и не допустить загрязнения предыдущим промывочным раствором следующего раствора. Результаты испытаний макета автоматического прибора для выделения ДНК количественно оценены при помощи известного серийного анализатора нуклеиновых кислот АНК-32 [29].

СПИСОК  ЛИТЕРАТУРЫ

1. G. Travaglini, H. Rohrer, M. Amrein, and H. Gross, Scanning tunneling microscopy on biological matter // Surf. Sci., -1987, - v. 181, - pp. 380-390.
2. D. D. Dunlap and C. Bustamante, Images of single-stranded nucleic acids by scanning tunneling microscopy // Nature, -1989, - v. 342, - pp. 204-206.
3. C. R. Clemmer and T. P. Beebe, Graphite: A mimic for DNA and other biomolecules in scanning tunneling microscopes studies // Science, -1991, - v. 251, - pp. 640-642.
4. W. M. Heckl and G. Binnig, Domain walls on graphite mimic DNA //  Ultramicroscopy, -1992, - v. 42-44, - pp. 1073-1078.
5. C. Bustamante, J. Vesenka, C. L. Tang, W. Rees, M. Guthod, and R. Keller, Circular DNA molecules imaged in air by scanning force microscopy // Biochemistry, -1992, - v. 31, - pp. 22-26.
6. J. Vesenka, M. Guthod, C. L. Tang, R. Keller, E. Delaine, and C. Bustamante, Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force microscope // Ultramicroscopy, -1992, - v. 42-44, - pp. 1243-1249.
7. T. Thundat, D. P. Allison, R. J. Warmack, G. M. Brown, K. B. Jacobson, J. J. Schrick, and T. L. Ferrell, Atomic force microscopy of DNA on mica and chemically modified mica // Scanning Microscopy, -1992, - v. 6, - No 4, - pp. 911-918.
8. N. H. Thomson, S. Kasas, B. Smith, H. G. Hansma, and P. K. Hansma, Reversible binding of DNA to mica for AFM imaging // Langmuir, -1996, - v. 12, - No 24, - pp. 5905-5908.Basic DNA and RNA Protocols, Methods in Molecular Biology. V. 58 / Harwood A.J. (editor). New Jersey: Humana Press, Totowa, 1994. P. 3–7.
9. M. N. Murray, H. G. Hansma, M. Bezanilla, T. Sano, D. F. Ogletree, W. Kolbe, C. L. Smith, C. R. Cantor, S. Spengler, P. K. Hansma, and M. Salmeron, Atomic force microscopy of biochemically tagged DNA // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, -1993, - v. 90, - pp. 3811-3814.
10. J. Hu, M. Wang, H.-U. G. Weier, P. Frantz, W. Kolbe, D. F. Ogletree, and M. Salmeron, Imaging of single extended DNA molecules on flat (aminopropyl)triethoxysilane-mica by atomic force microscopy //  Langmuir, -1996, - v. 12, - No 7, - pp. 1697-1700.
11. Y. L. Lyubchenko, A. A. Gall, L. S. Shlyakhtenko, R. E. Harrington, B. L. Jacobs, P. I. Oden, and S. M. Lindsay, Atomic force microscopy imaging of double stranded DNA and RNA // Journal of Biomolecular Structure & Dynamics, -1992, - v. 10, - No 3, - pp. 589-606.
12. Y. L. Lyubchenko, B. L. Jacobs, and S. M. Lindsay, Atomic force microscopy of reovirus dsRNA: a routine technique for length measurements //  Nucleic Acids Research, -1992, - v. 20, - No 15, - pp. 3983-3986.
13. Y. Lyubchenko, L. Schlyakhtenko, R. Harrington, and P. Oden, Atomic force microscopy of long DNA: imaging in air and under water // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, -1993, - v. 90, - pp. 2137-2140.
14. В. В. Прохоров, Д. В. Клинов, Е. В. Юркова, В. В. Демин, Исследование возможностей атомно-силовой микроскопии при картировании ДНК //  Материалы 16-ой Российской конференции по электронной микроскопии, -1996, - сс. 227.
15. H. G. Hansma, J. Vesenka, C. Siegerist, G. Kelderman, H. Morrett, P. L. Sinsheimer, V. Elings, C. Bustamante, and P. K. Hansma, Reproducible imaging and dissection of plasmid DNA under liquid with atomic force microscopy // Science, -1992, - v. 256, - pp. 1180-1184.
16. J. Yang and Z. Shao, The effect of probe force on the resolution of atomic force microscopy of DNA // Ultramicroscopy, -1993, - v. 50, - pp. 157-170.
17. Q. Zhong, D. Inniss, K. Kjoller, and V. B. Elings, Fractured polymer/silica fiber surface studied by tapping mode atomic force microscopy // Surf. Sci. Lett., -1993, - v. 290, - pp. L688- L692.
18. P. K. Hansma, J. P. Cleveland, M. Radmacher, D. A. Walters, P. E. Hillner, M. Bezanilla, M. Fritz, D. Vie, H. G. Hansma, C. B. Prater, J. Massie, L. Fukunaga, J. Gurley, and V. Elings, Tapping mode atomic force microscopy in liquids // Apll. Phys. Lett., -1994, - v. 64, - pp. 1738-1740.
19. H. G. Hansma, D. E. Laney, M. Bezanilla, R. L. Sinsheimer, and P. K. Hansma, Application for atomic force microscope of DNA // Biophisical Journal, -1995, - v. 68, - pp. 1672-1677.
20. A. K. Kleinschmidt and R. K. Zahn, Uber desoxyribonucleinsaure-molekulen in protein mischfilmen //  Zeitschrift fur Naturforschung, -1959, - v. 14b, - pp. 770-779.
21. A. K. Kleinschmidt, Monolayer techniques in electron microscopy of nucleic acids molecules, - v. XII of Methods in Enzymology. - New York: Academic Press, 1968.
22. J. Yang, K. Takeyasu, and Z. Shao, Atomic force microscopy of DNA molecules // FEBS Lett., -1992, - v. 301, - pp. 173-176.
23. A. Schaper, L. I. Pietrasanta, and T. M. Jovin, Scanning force microscopy of circular and linear plasmid DNA spread on mica with a quaternary ammonium salt // Nucleic Acids Res., -1993, - v. 21, - No 25, - pp. 6004-6009.
24. F. Jelen, V. Vetterl, A. Schaper, T. Jovin, and E. Palacek, Two-dimensional condensation of benzalkonium chloride at the mercury electrode and its relation to DNA imaging using scanning force microscopy // J. Electroanal. Chem., -1994, - v. 377, - pp. 197–203.
25. A. Schaper, J. P. P. Starink, and T. M. Jovin, The scanning force microscopy of DNA in air and in n- propanol using new spreading agents // FEBS Letters, -1994, - v. 355, - pp. 91-95.
26. H. Butt, T. Muller, and H. Gross, Immobilized biomolecules for scanning force microscopy by embedding in carbon // Journal of Structural Biology, -1993, - v. 110, - pp. 127-132.
27. L. A. Bottomley, J. N. Haseltine, D. P. Allison, R. J. Warmack, T. Thundat, R. A. Sachlebe, G. M. Brown, R. P. Woychik, K. B. Jacobson, and T. L. Ferrell, Scanning tunneling microscopy of DNA: The chemical modification of gold surfaces for immobilization of DNA // J. Vac. Sci. Technol. A, -1992, - v. 10, - No 4, - pp. 591-595.
28. D. P. Allison, T. Thundat, K. B. Jacobson, L. A. Bottomley, and R. J. Warmack, Imaging entire genetically functional DNA molecules with the scanning tunneling microscope // J. Vac. Sci. Technol A, -1993, - v. 11, - No 4, - pp. 816-819.
29. D. Dunlap, Scanning tunneling microscopy of DNA // IEEE engenering in medecine and biology, -1996, - v. 15, - No 1, - pp. 46-50.
30. R. Guckenberger, M. Heim, G. Cevc, H. F. Knapp, W. Wiegrabe, and A. Hillebrand, Scanning tunneling microscopy of insulators and biological specimens based on lateral conductivity of ultrathin water films // Science, -1994, - v. 266, - pp. 1538-1540.
31. H. G. Hansma, K. A. Browne, M. Bezanilla, and T. C. Bruice, Bending and staightening of DNA induced by the same ligand: characterization with the atomic force microscope // Biochemistry, -1994, - v. 33, - pp. 8436-8441.
32. W. A. Rees, R. W. Keller, J. P. Vesenka, G. Yang, and C. Bustamante, Evidence of DNA bending in transcription complexes imaged by scanning force microscopy // Science, -1993, - v. 260, - pp. 1646-1649.
33. M. Guthold, M. Bezanilla, D. A. Erie, B. Jenkins, H. G. Hansma, and C. Bustamante, Following the assembly of RNA polymerase-DNA complexes in aqueous solutions with the scanning force microscope // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, -1994, - v. 91, - No 26, - pp. 12927-12931.
34. Д. В. Клинов, Исследование биополимеров методами сканирующей зондовой микроскопии. Автореф. дис. ... канд. физ.-мат. наук, МФТИ, -М., 1997. -20 с.
35. D. V. Klinov, I. V. Lagutina, V. V. Prokhorov, T. Neretina, P. P. Khil, Y. B. Lebedev, D. I. Cherny, V. V. Demin, and E. D. Sverdlov, High resolution mapping DNAs by R-loop atomic force microscopy // Nucleic Acids Research, -1998, - v. 26, - No 20, - pp. 4603-4610.
36. G. U. Lee, L. A. Chrisey, and R. J. Colton, Direct measurements of the forces between complementary strands of DNA // Science, -1994, - v. 266, - pp. 771–773.
37. Klintschar M., Neuhuber F. Evaluation of an Alkaline Lysis Method for the Extraction of DNA from Whole Blood and Forensic Stains for STR Analysis // Forensic Sci. 2000. V. 45. P. 669–673.
38. Moss D., Harbison S.A., Saul D.J. An Easily Auto-mated, Closed-Tube Forensic DNA Extraction Pro-cedure Using a Thermostable Proteinase // Int. J. Legal Med. 2003. V. 117. P. 340–349.
39. Wilcockson J. The Use of Sodium Perchlorate in Deproteinization During the Preparation of Nucleic Acids // Biochem. J. 1973. V. 135. P. 559–561.
40. Bowtell D.D. Rapid Isolation of Eukaryotic DNA // Anal. Biochem. 1987. V. 162. P. 463–465.
41. Graham D.E. The Isolation of High Molecular Weight DNA from Whole Organisms or Large Tis-sue Masses // Anal. Biochem. 1978. V. 85, N 2. 609–613.
42. Breadmore M.C., Wolfe K.A., Arcibal I.G., et al. Microchip-Based Purification of DNA from Biological Samples // Anal. Chem. 2003. V. 75. P. 1880– 1886.
43. Teeters M.A., Conrardy S.E., Thomas B.L., et al. Adsorptive Membrane Chromatography for Purification of Plasmid DNA // J. Chromatogr. A. 2003. 989. P. 165–173.
44. Boom R., Sol C.J., Salimans M.M., et al. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids // Clin. Microbiol. 1990. V. 28. P. 495–503.
45. Walsh P.S., Metzger D.A., Higuchi R. Chelex 100 as a Medium for Simple Extraction of DNA for PCR-Based Typing from Forensic material // Biotechniques. 1991. V. 10, N 4. P. 506–513.
46. Coombs L.M., Pigott D., Proctor A., et al. Simultaneous Isolation of DNA, RNA and Antigenic Protein Exhibiting Kinase Activity from Small Tumour Samples Using Guanidine Isothiocyanate // Anal. Biochem. 1990. V. 188. P. 338–343.
47. Chirgwin J.M., Przybyla A.E., MacDonald R.J., Rutter W.J. Isolation of Biologically Active Ribonucleic Acid from Sources Enriched in Ribonuclease // Biochemistry. 1979. V. 18. P. 5294–5299.
48. Zarlenga D.S., Gamble H.R. Simultaneous Isolatton of Preparative Amounts of RNA and DNA from Tri-chinella Spirahsby Cesium Trifluoroacetate Isopycnic Centrifugation // Anal. Blochem. 1987. V. 162. 569–574.
49. Meese E., Blin N. Simultaneous Isolation of High Molecular Weight RNA and DNA from Limited Amounts of Tissues and Cells // Gene Anal. Tech. 1987. V. 4. P. 4549.
50. Raha S., Merante F., Proteau G., Reed J.K. Simultaneous Isolation of Total Cellular RNA and DNA from Tissue Culture Cells Using Phenol and Lithium Chloride // Gene Anal. Tech. 1990. V. 7. P. 173– 177.
51. Wallace D.M. Large and Small Scale Phenol Extractions // Methods in Enzymology. Guide to Molecular Cloning Techniques. V. 152 / Eds. Berger S.L. and Kimmel A.R. FL, Orlando: Academic, 1987. P. 33– 41.
52. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. NY: Cold Spring Harbor Laboratory, 1989.
53. Krieg P., Amtmann E., Sauer G. The Simultaneous Extraction of Highmolecular-Weight DNA and of RNA from Sohd Tumours // Anal. Biochem. 1983. 134. P. 288–294.
54. Demeke T., Adams R.P. The Effects of Plant Polysaccharides and Buffer Additives on PCR // Biotechniques. 1992. V. 12. P. 332–334.
55. Hoorfar J., Cook N., Malorny B., et al. Making Internal Amplification Control Mandatory for Diagnostic PCR // J. Clin. Microbiol. 2003. V. 41. 5835.
56. Suffys Ph., Vanderborght P.R., Barros dos Santos P., et al. Inhibition of the Polymerase Chain Reaction by Sputum Samples from Tuberculosis Patients after Processing Using a Silicaguanidinium-thiocyanate DNA Isolation Procedure // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, 2001. V. 96, N 8. P. 1137–1139.
57. Stadler J., Lemmens R., Nyhammar T. Plasmid DNA Purification // J. Gene Med. 2004. V. 6. P. S54–S66.
58. Birnboim H.C., Doly J.A. Rapid Alkaline Extraction Procedure for Screening Recombinant Plasmid DNA // Nucleic Acid. Res. 1979. V. 7. P. 1513– 1523.
59. Birnboim H.C. A Rapid Alkaline Extraction Method for the Isolation of Plasmid DNA // Methods Enzymol. 1983. V. 100. P. 243–255.
60. Chiang C.-L., Sung C.-S., Wu T.-F., et al. Applica-tion of Superparamagnetic Nanoparticles in Purification of Plasmid DNA from Bacterial Cells // J. Chromatogr. B. 2005. V. 822. P. 54–60.
61. Satokari R.M., Kataja K., Soderlund H. Multiplexed Quantification of Bacterial 16S rRNA by Solution Hybridization with Oligonucleotide Probes and Affinity Capture // Microb. Ecol. 2005. V. 50. Р. 120– 127.
62. Berensmeier S. Magnetic Particles for the Separation and Purification of Nucleic Acids // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 73. P. 495–504.
63. Jacobsen N., Nielsen P.S., Jeffares D.C., et al. Di-rect Isolation of Poly(A)(+) RNA from 4 M Guanidine Thiocyanate-Lysed Cell Extracts Using Locked Nucleic Acid-Oligo(T) Capture // Nucleic Acids Res. 2004. V. 32. P. e64.
64. Алексеев Я.И., Белов Ю.В., Варламов Д.А. и др. Приборы для диагностики биологических объектов на основе метода полимеразной цепной ре-акции в реальном времени (ПЦР-РВ) // Научное приборостроение. 2006. Т. 16, № 3. C. 132–136.
65. Ичас М. Биологический код. М., 1971
66. Шабарова З.А., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов, М., 1978
67. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М., 1987
68. Для подготовки данной работы были использованы материалы с сайта http://bio.freehostia.com
69. Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор – Биология.
70. З.А. Шабарова и А.А. богданов – Химия нуклеиновых кислот и их полимеров.
71. А.П. Пехов – Биология и общая гинетика.
72. А. Микельсон – Химия нуклеозидов и нуклеотидов.
73. Ванюшин Б. Ф. Глава 23. Молекулярная биология // История биологии с начала XX века до наших дней. М.: Наука. 1975. с. 454
74. Chargaff, E., R. Lipshitz, C. Green and M. E. Hodes The composition of the deoxyribonucleic acid of salmon sperm Journal of Biological Chemistry (1951) Vol. 192. p. 223-230.