Методы выделения нуклеиновых кислот из биологического материала

Примечание. Н. д. — нет данных

6 Другие методы выделения нуклеиновых  кислот

6.1 Определение первичной структуры (секвенирование) нуклеиновых кислот.

 

Секвенирование  нуклеиновых кислот позволяет определить в одном эксперименте последовательность нуклеотидов в ДНК или РНК, содержащих несколько сотен мономерных звеньев. Методы основаны на общем принципе - определении с помощью высокоразрешающего электрофореза в полиакриламидном геле с точностью до одного нуклеотида длины всех возможных фрагментов секвенируемого участка нуклеиновой кислоты, содержащих на одном конце одну и ту же последовательность нуклеотидов (гомогенный фрагмент), а на другом - один и тот же нуклеотид. Такие фрагменты получают двумя различными способами. В первом случае (метод Максама-Гилберта) гомогенный фрагмент ДНК или РНК, предварительно меченный радиоактивной меткой по одному из концов, расщепляют хим. агентами, специфичными к одному из четырех нуклеотидных остатков (A, G, С, Т или U); в случае РНК этот процесс осуществляют также специфическими рибонуклеазами. Расщепление ведут в таких ограничивающих условиях, когда в каждой молекуле нуклеиновой кислоты расщепляется только одна меж нуклеотидная связь рядом с нуклеотидом данного типа, независимо от его положения в цепи. Такую операцию проводят для каждого из четырех нуклеотидных остатков и по длинам образующихся радиоактивных фрагментов определяют положение каждого нуклеотида в цепи нуклеиновой кислоты.

В др. случае (метод Сенгера) используют олиго- или полинуклеотидную затравку (праймер) известной длины, комплементарную определенному участку нуклеиновой кислоты. Затравку наращивают с помощью ДНК-полимеразы, останавливая синтез на одном из четырех типов нуклеотидных остатков с равной вероятностью, независимо от его положения в цепи. Для этого к смеси четырех прир. субстратов ДНК-полимеразы добавляют так называемый терминатор (обычно 2', 3'-ди-дезоксинуклеозидтрифосфат) - аналог определяемого нуклеотидного остатка, попадание которого на 3'-конец растущей цепи останавливает синтез. При этом радиоактивная метка вводится либо в затравку, либо в субстрат. Операцию повторяют для каждого из четырех нуклеотидов; длину образующихся радиоактивных фрагментов определяют стандартным способом. Эти методы в настоящее время удалось полностью автоматизировать (заменив в ряде случаев радиоактивную метку на флуоресцентную) и тем самым в тысячи раз повысить скорость секвенирования ДНК.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6.3 Спектрофотометрический анализ

Нуклеиновые кислоты определенным образом поглощают  ультрафиолет. В спектрофотометрах образец подвергается действию ультрафиолета с длиной волны 260 нм, а фотодетектор измеряет количество света, прошедшего через образец. Чем больше света поглощено, тем выше концентрация нуклеиновой кислоты в образце.

При помощи закона Бугера — Ламберта — Бера возможно соотнести концентрация молекул, поглощающих излучение с количеством поглощенного света. На длине волны 260 нм средний коэффициент экстинкции для двуцепочечной ДНК составляет 0,020 (мкг/мл)⁻¹ см⁻¹, для одноцепочечной ДНК 0,027 (мкг/мл)⁻¹ cm⁻¹, для одноцепочечной РНК 0,025 (мкг/мл)⁻¹ cm⁻¹ и для коротких одноцепочечных олигонуклеотидов коэффициент экстинкции зависит от длины и соотношения азотистых оснований (около 0,030 (мкг/мл)⁻¹ cm⁻¹). Отсюда, оптическая плотность равная 1 соответствует концентрации двуцепочечной ДНК около 50 мкг/мл. Спектрофотометрический способ определения концентрации нуклеиновых кислот применяет при концентрациях до 2 OD. Более точные коэффициенты экстинкции требуются для определения концентрации олигонуклеотидов, и могут быть предсказаны при помощи модели ближайшего соседства.

Коэффициенты пересчета

 

Тип нуклеиновой кислоты	Концентрация (мкг/мл) для 1 единицы A260
dsDNA (двуцепочечная ДНК)	50
ssDNA (одноцепочечная ДНК)	37
ssRNA (одноцепочечная РНК)	40

 

Кюветы для анализа

Для определения концентрации образца, оптическую плотность, определённую при  помощи стандартной кюветы с величиной  оптического пути 10 мм, необходимо умножить на соответствующий коэффициент. Например, величина поглощения 0,9 оптических единицы двуцепочечной ДНК соответствует концентрации 45 мкг/мл.

Кюветы малого объема

Для многих биологических исследований требуется (ДНК-микрочип, количественная ПЦР) качественное и количественное определение малых объемов нуклеиновых кислот. Специальные нанофотометры позволяют определять концентрации образцов без помощи кюветы в субмикролитровых объемах, начиная от 0,3 мкл. Так как производятся измерения неразбавленного образца, воспроизводимость результатов очень высокая, а сами образцы могут быть использованы после анализа.

Чистота образца

Часто образцы нуклеиновых  кислот содержат примеси белков и  других органических веществ. Отношение  поглощения на длинах волн 260 и 280 нм (A_260/280) часто используют для оценки чистоты препарата. Чистая ДНК имеет соотношение A_260/280 порядка 1,8, образец РНК без примесей A_260/230 около 2.

Примеси белков и отношение 260:280

Для выявления примесей белков в растворах  нуклеиновых кислот, анализируют  соотношение поглощения растворов  на длинах волн 260 и 280 нм, ароматические  аминокислоты в составе белков поглощают  на 280 нм. Однако вклад примесей белков в определение концентрации нуклеиновых  кислот небольшой — для того, чтобы повлиять на соотношение 260:280 в растворе нуклеиновой кислоты, концентрация белка должна быть значительной.

Отношение 260:280 позволяет определить примесь  нуклеиновых кислот в растворах  белков и примесей белков в растворах  нуклеиновых кислот:

% белка	% нуклеиновой кислоты	отношение 260:280
100	0	0,57
95	5	1,06
90	10	1,32
70	30	1,73

В случае определения примеси белка в  растворе нуклеиновой кислоты отношение 260:280 имеет меньшую чувствительность :

% нуклеиновой кислоты	% белка	отношение 260:280
100	0	2,00
95	5	1,99
90	10	1,98
70	30	1,94

Такие отличия обусловлены более высоким  значением коэффициента молярной экстинкции в случае нуклеиновых кислот на длинах волн 260 и 280 нм, в сравнении с белками. Поэтому даже для раствора белка  относительно высокой концентрации вклад в поглощение на длинах волн 260 и 280 нм небольшой. Определение белкового  загрязнения в растворе нуклеиновой  кислоты не может быть определен  по соотношению 260:280, поэтому примеси  белков в растворах нуклеиновых  кислот вносят незначительную погрешность  в определение концентрации ДНК  и РНК.

Другие  загрязнения:

• Загрязнения фенолом, который часто используют при выделении нуклеиновых кислот, может приводить к значительным погрешностям при измерении концентрации нуклеиновых кислот. Фенол имеет максимальное поглощение на длине волны 270 нм и соотношение A_260/280 около 1.2. Нуклеиновые кислоты, не содержащие фенол, имеют соотношение A_260/280 около 2. Примеси фенола могут значительно завысить концентрацию ДНК.
• Поглощение на длине волны 230 нм могут быть вызваны загрязнениями фенолятами, тиоцианатами и другими органическими соединениями. Для чистого образца РНК отношение A_260/230 должно быть около 2, для чистого образца ДНК A_260/230 около 1,8.
• Поглощение на длине волны 330 нм и выше указывает на другие загрязнения раствора. Поглощение на этих длинах волн для чистых препаратов нуклеиновых кислот должно быть равно нулю.
• Отрицательные значения могут быть вызваны неверным выбором раствора, использованного в качестве пустого (blank). Также отрицательные значения могут быть следствием наличия флюоресцентного красителя в растворе.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6.3 Амплификация нуклеиновых кислот

Процесс амплификации основан на многократном увеличении числа копий фрагмента нуклеиновых  кислот (ДНК/(кДНК)/РНК) или усилении сигнала в условиях in vitro, что позволяет  обнаружить специфичный участок  генома возбудителя с целью его  идентификации.

6.3.1 Методы амплификации нуклеиновых кислот

Методы амплификации нуклеиновых кислот: полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция (ЛЦР), амплификация с удалением (вытеснением) цепи (SDA), транскрипционно-опосредованная амплификация (TMA), реакция амплификации на основе нуклеотидной последовательности нуклеиновых кислот (NASBA), реакция  изотермальной транскрипционной амплификации (TAS), самоподдерживающаяся реакция  репликации последовательностей (SSSR или 3SR), амплификация с использованием QB-репликазы, амплификации по типу катящегося кольца (RCA) и т.д.

Методы амплификации сигнала: сигнальная амплификация или метод "разветвленной" ДНК (bDNA assay), прямой гибридизационный анализ на основе РНК/ДНК-зондов и т.д.

Разновидности полимеразной цепной реакции: с "горячим" стартом (hot-start PCR), мультиплексная (мультипраймерная), гнездовая ("вложенная", nested PCR), "инвертированная", ассиметричная, метод молекулярных колоний, длинных фрагментов (Long-range PCR), с быстрой амплификацией концов кДНК (RACE-PCR), универсальная (broad-range PCR), с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR), иммуно-ПЦР (immuno-PCR-IPCR), в режиме "реального времени" (Real-Time PCR), анализ "по конечной точке" (End-point PCR) и т.д.

6.3.2 Форматы амплификации нуклеиновых кислот в режиме "реального времени":

- с применением  интеркалирующих флуоресцентных  красителей;

- использование  меченых флуоресцентными красителями  олигонуклеотидных зондов, комплементарных  участку ампликона (гибридизационно-флуоресцентная  детекция), работающих по принципу: гидролиза зондов (линейно разрушаемые  зонды (TaqMan)), зондов с инвертированным  концевым повтором (молекулярные "маячки", molecular beacons), праймер-зондов ("скорпионы", Scorpions), гибридизации зондов (с резонансным  переносом энергии (FRET-технология)), "амплифлюр" (Amplifluor)-технологии  и т.д.

Методы исследования, использующие продукты амплификации нуклеиновых  кислот: секвенирование, ДНК-чипы, рестрикционный анализ.

Методы детекции продуктов  амплификации нуклеиновых кислот:

- электрофоретический  (в агарозном или полиакриламидном  геле);

- гибридизационно-ферментный;

- гибридизационно-флуоресцентный (детекция продукта в режиме "реального  времени" или регистрация продукта  после окончания реакции амплификации ("анализ по конечной точке")).

Форматы исследования: качественный, количественный.

6.3.3 Методы амплификации нуклеиновых кислот микроорганизмов I - IV групп

Методы амплификации нуклеиновых кислот микроорганизмов I - IV групп патогенности используют:

- как метод экспресс-диагностики  при исследовании биологического  материала, взятого от человека, с целью выявления ДНК (РНК)  микроорганизмов I - IV групп патогенности  и их количественной оценки;

- как метод специфической  индикации патогенных биологических  агентов в объектах окружающей  среды и пищевых продуктах;

- как ускоренный предварительный  тест при выполнении культурального  и биологического методов исследования  и для идентификации культур;

- для определения эпидемиологической  значимости изолятов на основании  выявления генетических маркеров  вирулентности и патогенности, антибиотикоустойчивости;

- для таксономической  характеристики штаммов на основании  выявления специфических видовых,  родовых и других маркеров;

- для генотипирования  штаммов с целью определения  их происхождения;

- для прогнозирования  течения инфекционного заболевания  и оценки эффективности проводимой  терапии.

Основные  характеристики наборов реагентов, используемых для проведения амплификации нуклеиновых кислот микроорганизмов I - IV групп патогенности: аналитическая  чувствительность, аналитическая специфичность, диагностическая чувствительность, диагностическая специфичность, воспроизводимость.

По результатам  анализа выдают ответ о наличии (качественный или количественный анализ) в пробе специфических фрагментов ДНК или РНК, имеющих гомологию  с определенным участком генома возбудителя  инфекционного заболевания, а также  о наличии в исследуемом материале  генетических маркеров или генетически  модифицированных ДНК.

 

 

 

 

6.4 Метод количественного  анализа нуклеиновых кислот

 

Количественный  анализ нуклеиновых кислот — определение концентрации ДНК или РНК в смеси или чистом препарате. Реакции с участием нуклеиновых кислот часто требуют точных сведений о количестве и чистоте препарата. Для определения концентрации нуклеиновой кислоты в растворе используют спектрофотометрический метод и УФ-флюоресценцию, если нуклеиновая кислота содержит краситель.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

6.5 Сканирующая  зондовая микроскопия нуклеиновых  кислот

Среди множества биологических объектов, к исследованию которых применялись  методы зондовой микроскопии, первой была молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты. Однако на начальном этапе этих исследований отмечались сложности в интерпретации  получаемых изображений. Так, авторы работ [1,2] представили данные сканирующей туннельной микроскопии молекул ДНК, адсорбированных на подложку из высокоориентированного пиролитического графита (пирографита). Выбор данного материала в качестве подложки был обусловлен его проводящими свойствами, а также простотой приготовления атомарно гладких участков поверхности значительной площади. На СТМ-изображениях наблюдались протяженные цепочки, обладающие продольной периодичностью (период около 2-3 нм), на основании чего авторы делали вывод о визуализации витков двойной спирали.