Методы выделения нуклеиновых кислот из биологического материала

1. Количество аденина равно количеству тимина, а гуанина — цитозину: А=Т, Г=Ц.
2. Количество пуринов равно количеству пиримидинов: А+Г=Т+Ц.
3. Количество оснований с аминогруппами в положении 6 равно количеству оснований с кетогруппами в положении 6: А+Ц=Г+Т.

 

Вместе с тем, соотношение (A+Т):(Г+Ц) может быть различным у ДНК  разных видов. У одних преобладают  пары АТ, в других — ГЦ.

Правила Чаргаффа, наряду с данными  рентгеноструктурного анализа, сыграли  решающую роль в расшифровке структуры  ДНК Дж. Уотсоном и Фрэнсисом Криком.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.3 Функция нуклеиновых кислот

Одна из основных функций нуклеиновых  кислот состоит в детерминации синтеза  белков. Информация о структуре белков, закодированная в нуклеотидной последовательности ДНК, должна передаваться от одного поколения  к другому, и поэтому необходимо ее безошибочное копирование, т.е. синтез точно такой же молекулы ДНК (репликация).

1.3.1 Репликация и транскрипция.

С химической точки зрения синтез нуклеиновой кислоты – это  полимеризация, т.е. последовательное присоединение строительных блоков. Такими блоками служат нуклеозидтрифосфаты.

Энергия, необходимая для синтеза, высвобождается при отщеплении пирофосфата, а катализируют реакцию особые ферменты – ДНК-полимеразы.

В результате такого синтетического процесса мы получили бы полимер со случайной последовательностью  оснований. Однако большинство полимераз  работает только в присутствии уже  существующей нуклеиновой кислоты  –матрицы, диктующей, какой именно нуклеотид присоединится к концу  цепи. Этот нуклеотид должен быть комплементарен соответствующему нуклеотиду матрицы, так что новая цепь оказывается  комплементарной исходной. Используя  затем комплементарную цепь в  качестве матрицы, мы получим точную копию оригинала.

ДНК состоит из двух взаимно комплементарных  цепей. В ходе репликации они расходятся, и каждая из них служит матрицей для синтеза новой цепи:

Так образуются две новые двойные  спирали с той же последовательностью  оснований, что и у исходной ДНК. Иногда в процессе репликации происходит «сбой», и возникают мутации .

В результате транскрипции ДНК образуются клеточные РНК (мРНК, рРНК и тРНК):

Они комплементарны одной из цепей  ДНК и являются копией другой цепи, за исключением того, что место  тимина у них занимает урацил. Таким  способом можно получить множество  РНК-копий одной из цепей ДНК.

В нормальной клетке передача информации осуществляется только в направлении  ДНК → ДНК и ДНК → РНК. Однако в клетках, инфицированных вирусом, возможны и другие процессы: РНК → РНК и РНК → ДНК. Генетический материал многих вирусов представлен молекулой РНК, обычно одноцепочечной. Проникнув в клетку-хозяина, эта РНК реплицируется с образованием комплементарной молекулы, на которой, в свою очередь, синтезируется множество копий исходной вирусной РНК:

Вирусная РНК может транскрибироваться ферментом (обратной транскриптазой) в ДНК, которая иногда включается в хромосомную ДНК клетки-хозяина. Теперь эта ДНК несет вирусные гены, и после транскрипции в клетке может появиться вирусная РНК. Таким образом, спустя длительное время, в течение которого никакого вируса в клетке не обнаруживается, он снова в ней появится без повторного заражения. Вирусы, генетический материал которых включается в хромосому клетки-хозяина, часто являются причиной рака.

1.3.2 Трансляция

Генетическая информация, закодированная в нуклеотидной последовательности ДНК, переводится не только на язык нуклеотидной последовательности РНК, но и на язык аминокислот – мономерных единиц белков.

Белковая молекула – это цепочка  из аминокислот. Каждая аминокислота содержит кислую карбоксильную группу –COOH и  осн вную аминогруппу

–NH2. Карбоксильная группа одной  аминокислоты связывается с аминогруппой другой, образуя амидную связь, и  этот процесс продолжается, пока не образуется цепь, содержащая до 1000 аминокислот .

В белках присутствует 20 разных аминокислот, от последовательности которых зависят  их природа и функции. Эта последовательность определяется нуклеотидной последовательностью  соответствующего гена – участка  ДНК, кодирующего данный белок. Однако сама ДНК не является матрицей при  синтезе белка. Сначала она транскрибируется в ядре с образованием матричной  РНК (мРНК), которая диффундирует в  цитоплазму, и на ней как на матрице  синтезируется белок. Процесс ускоряется благодаря тому, что на каждой молекуле мРНК может одновременно синтезироваться  множество белковых молекул.

Репликация нуклеиновых кислот осуществляется благодаря образованию  водородных связей между комплементарными основаниями исходной и дочерней цепей. Аминокислоты не образуют водородных связей с основаниями, так что  прямое копирование матрицы невозможно. Они взаимодействуют с матрицей опосредованно, через «адапторные» нуклеиновые кислоты – небольшие  молекулы транспортных РНК (тРНК), состоящие  примерно из 80 оснований и способные  связываться с мРНК.

Каждая тРНК содержит специфическую  последовательность из трех оснований, антикодон, который комплементарен группе из трех оснований, кодону, в  мРНК. Антикодоны взаимодействуют с  кодонами по правилу комплементарности, примерно так же, как взаимодействуют  две цепи ДНК. Таким образом, последовательность оснований в мРНК определяет порядок  присоединения тРНК, несущих аминокислоты. Схематически перенос информации от ДНК к белку можно представить  следующим образом:

Последовательность оснований  в ДНК задает порядок следования аминокислот в белке, поскольку  каждая аминокислота присоединяется специфическим  ферментом только к определенным тРНК, а те, в свою очередь, – только к определенным кодонам в мРНК. Комплексы тРНК-аминокислота связываются  с матрицей по одному в каждый данный момент времени. Ниже перечислены основные этапы белкового синтеза (см. также  рисунок).

1. Ферменты, называемые аминоацил-тРНК-синтетазами,  присоединяют аминокислоты к  соответствующим тРНК. Таких ферментов  20, по одному для каждой аминокислоты.

2. Молекула мРНК присоединяется  своим первым кодоном к небольшой  частице, называемой рибосомой.  Рибосомы состоят из примерно  равных количеств рРНК и белка.  Структура и функция рибосом  весьма сложны, но главная их  задача – облегчение взаимодействия  мРНК и тРНК и ускорение  полимеризации аминокислот, связанных  с разными тРНК.

3. тРНК, нагруженная аминокислотой,  связывается с соответствующим  кодоном мРНК, которая, в свою  очередь, контактирует с рибосомой.  Образуется комплекс рибосома-мРНК-тРНК-аминокислота.

4. мРНК, подобно ленте на конвейере,  продвигается по рибосоме на  один кодон вперед.

5. Следующая тРНК, нагруженная аминокислотой,  присоединяется ко второму кодону.

6. Первая и вторая аминокислоты  связываются между собой. 

7. Первая тРНК отсоединяется  от комплекса, и теперь вторая  тРНК несет две аминокислоты, связанные между собой. 

8. мРНК снова продвигается на  один кодон вперед, и все события  повторяются, а растущая аминокислотная  цепь удлиняется на одну аминокислоту. Процесс продолжается, пока не  будет достигнут последний, «стоп»-кодон  и последняя тРНК не отделится  от готовой белковой цепи. В  бактериальных клетках цепь из 100–200 аминокислот собирается за  несколько секунд. В животных  клетках этот процесс занимает  около минуты.

1.3.3 Транспортные РНК и супрессия

Смысл информации, содержащейся в  ДНК, если переводить ее на язык аминокислот, определяется как самой ДНК, так  и считывающим механизмом, т.е. зависит  не только от того, какие кодоны есть в ДНК и в какой последовательности они расположены, но также и от того, какие именно аминокислоты (и  к каким тРНК) присоединяют аминоацил-тРНК-синтетазы. Конечно, природа синтетаз и тРНК тоже определяется ДНК, и в этом смысле ДНК является первичным детерминантом  белковой последовательности. Тем не менее суммарная детерминация представляет собой функцию всей системы, поскольку  результат зависит от исходных компонентов. Если бы соответствие между тРНК и  аминокислотами было другим, смысл  кодонов тоже изменился бы.

Известно, что мутации в ДНК  изменяют считывающий механизм и  в результате меняют – пусть и  незначительно – смысл кодонов. Так, в бактерии Escherichia coli глициновая тРНК обычно узнает в мРНК кодон  ГГА; мутация в ДНК, с которой  транскрибируется эта тРНК, изменяет антикодон глициновой тРНК таким  образом, что теперь он узнает кодон  АГА, соответствующий аргинину, и  в белковой молекуле вместо аргинина появляется глицин. Это не обязательно  имеет фатальные последствия, поскольку  не все аргинины кодируются триплетом  АГА и есть аргининовые тРНК, по-прежнему узнающие «свои» АГА. В результате измененными  оказываются не все белковые молекулы. Иногда такие мутации, изменяющие антикодон, подавляют (супрессируют) мутации в  кодоне. Например, если в результате мутации глициновый кодон ГГА  превращается в АГА, он все же может  прочитываться как глицин, если антикодон  глициновой тРНК, в свою очередь, изменился  так, что эта тРНК стала узнавать АГА. В этом случае вторая «ошибка» устраняет первую.

Мутации, приводящие к изменению  антикодонов, могут иметь разные последствия, поскольку один и тот  же кодон может узнаваться несколькими  тРНК. Вообще говоря, узнавание осуществляется благодаря комплементарности оснований  кодона и антикодона, однако одно из оснований кодона может модифицироваться таким образом, что антикодон  будет узнавать даже не полностью комплементарный кодон. В результате одна и та же тРНК может взаимодействовать с несколькими разными кодонами, кодирующими одну и ту же аминокислоту. Этот феномен неполного соответствия кодона и антикодона был назван Ф.Криком «шатанием».

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.4 Значение нуклеиновых кислот

 

Значение нуклеиновых кислот очень  велико. Особенности их химического  строения обеспечивают возможность  ранения, переноса в цитоплазму и  передачи по наследству дочерним клеткам  информации о структуре белковых молекул, которые синтезируются  в каждой клетке. Белки обусловливают  большинство свойств и признаков  клеток. Понятно поэтому, что стабильность структуры нуклеиновых кислот - важнейшее  условие нормальной жизнедеятельности  клеток и организма в целом. Любые  изменения строения нуклеиновых  кислот влекут за собой изменения  структуры клеток или активности физиологических процессов в  них, влияя таким образом на жизнеспособность.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

2 Макромолекулярная структура ДНК

 В 1953 г. Уотсон и Крик, опираясь  на известные данные о конформаци  нуклеозидных остатков, о характере  межнуклеотидной связи в ДНК  и закономерности нуклеотидного  состава ДНК (правила Чаргаффа), расшифровали рентгенограммы паракристаллической  формы ДНК [так называемой В-формы,  образующейся при влажности выше 80% и при высокой концентрации  противоионов (Li+) в образце]. Согласно  их модели, молекула ДНК представляет  собой правильную спираль, образованную  двумя полидезоксирибонуклеотидными  цепями, закрученными относительно  друг друга и вокруг общей  оси. Диаметр спирали практически  постоянен вдоль всей ее длины  и равен 1,8 нм (18 А).

Макромолекулярная структура ДНК.

(а)—Модель Уотсона — Крика;

(6)—параметры спиралей В-, С-  и Т-форм ДНК (проекции перпендикулярно  оси спирали);

(в)—поперечный разрез спирали  ДНК в В-форме (заштрихованные  прямоугольники изображают пары  оснований);

(г)—параметры спирали ДНК в  А-форме; 

(д)—поперечный разрез спирали  ДНК в А-форме.

 Длина витка спирали, который  соответствует ее периоду идентичности, составляет 3,37 нм (33,7 А). На один виток  спирали приходится 10 остатков оснований  в одной цепи. Расстояние между  плоскостями оснований равно,  таким образом, примерно 0,34 нм (3,4 А). Плоскости остатков оснований  перпендикулярны длинной оси  спирали. Плоскости углеводных  остатков несколько отклоняются  от этой оси (первоначально  Уотсон и .Крик предположили, что  они параллельны ей).

 Из рисунка видно, что углеводофосфатный  остов молекулы обращен наружу. Спираль закручена таким образом,  что на ее поверхности можно  выделить две различные по  размерам бороздки (их часто называют  также желобками) — большую,  шириной примерно 2,2 нм (22 А), и малую  — шириной около 1,2 нм (12А). Спираль  — правовращающая. Полидезоксирибонуклеотидные  цепи в ней антипараллельны:  это означает, что если мы будем  двигаться вдоль длинной оси  спирали от одного ее конца  к другому, то в одной цепи  мы будем проходить фосфодиэфирные  связи в направлении 3'à5', а  в другой — в направлении  5'à3'. Иными словами, на каждом  из концов линейной молекулы  ДНК расположены 5'-конец одной  и 3'-конец другой цепи.