Методы выделения нуклеиновых кислот из биологического материала

МИНОБРНАУКИ РФ

 

Тверской государственный технический  университет

 

Кафедра биотехнологии  и химии

 

 

 

 

 

 

 

 

Реферат

 

 

по дисциплине «Биохимия»

 

на тему:

 

 

Методы выделения нуклеиновых  кислот из биологического материала

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Тверь 2013

 

Содержание

ВВЕДЕНИЕ 4

1 Нуклеиновые  кислоты 5

1.1 Типы и  распространение нуклеиновых кислот. 6

1.2 Общие свойства  нуклеиновых кислот 7

1.2.1 Химическая  структура. 7

1.2.2 Трехмерная  структура. 7

1.2.3 Правило  комплементарности 8

1.2.4 Правила  Чаргаффа 8

1.3 Функция  нуклеиновых кислот 10

1.3.1 Репликация  и транскрипция. 10

1.3.2 Трансляция 11

1.3.3 Транспортные  РНК и супрессия 13

1.4 Значение  нуклеиновых кислот 14

2 Макромолекулярная  структура ДНК 15

2.1 Выделение  дезоксирибонуклеиновых кислот 17

2.1.1 Фракционирование  ДНК 17

3 Макромолекулярная  структура РНК 18

3.1 Выделение  рибонуклеиновых кислот 19

3.1.1 Фракционирование  РНК 19

4 Жидкофазные  методы выделения нуклеиновых  кислот 22

4.1 Классические  методы выделения нуклеиновых  кислот 22

4.2 Методы, позволяющие  выделить ДНК и РНК одновременно 22

5 Твердофазные  методы выделения нуклеиновых  кислот 24

5.1 Основные  принципы твердофазных методов 24

5.1.1 Метод  выделения нуклеиновых кислот  на стекле 24

5.1.2 Метод  на основе магнитной сепарации 25

6 Другие методы  выделения нуклеиновых кислот 28

6.1 Определение  первичной структуры (секвенирование) нуклеиновых кислот. 28

6.3 Спектрофотометрический  анализ 30

6.3 Амплификация  нуклеиновых кислот 33

6.3.1 Методы  амплификации нуклеиновых кислот 33

6.3.2 Форматы  амплификации нуклеиновых кислот  в режиме "реального времени": 33

6.3.3 Методы  амплификации нуклеиновых кислот  микроорганизмов I - IV групп 34

6.4 Метод количественного  анализа нуклеиновых кислот 35

6.5 Сканирующая  зондовая микроскопия нуклеиновых  кислот 36

6.5.1  Основные методики препарирования образцов для зондовой микроскопии нуклеиновых кислот 36

6.5.2  Применение зондовой микроскопии для исследования структуры и свойств молекул нуклеиновых кислот и их комплексов 40

7 Заключение 41

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 42

 

ВВЕДЕНИЕ

 

Выделение ДНК и РНК — важный шаг подготовки проб перед биохимическими и диагностическими процессами. Многие приложения, такие как амплификация, проведение обратной транскрипции, детектирование накопления продуктов амплификации методом ПЦР в реальном времени, клонирование, секвенс, гибридизация, синтез ДНК и т. д., не могут быть выполнены непосредственно на биологических образцах без предварительной очистки нуклеиновых кислот.

 

При выборе метода выделения необходимо учитывать приоритет предъявляемых к нему требований, таких как высокий выход нужной нуклеиновой кислоты, быстрота метода, большая пропускная способность или высокое качество продукта. Существуют различные методы, позволяющие выделять нуклеиновые кислоты из широкого спектра образцов, но лишь малое их число пригодно для автоматизации. Присутствие загрязняющих веществ, например белков или карбогидратов, в таких комплексных смесях часто мешает реализовать необходимые реакции и методики.

 

Методы  выделения нуклеиновых кислот можно  разделить по основным физическим и биохимическим признакам на следующие классы:

 

• жидкофазные методы;
• твердофазные методы;
• фракционирование ДНК и РНК

 

Для начала рассмотрим, что же представляют из себя нуклеиновые кислоты и  по какому принципу из них строятся молекулы ДНК и РНК.

 

1 Нуклеиновые кислоты

Нуклеиновые кислоты, биополимеры, состоящие из остатков фосфорной  кислоты, сахаров и азотистых  оснований (пуринов и пиримидинов). Имеют фундаментальное биологическое  значение, поскольку содержат в закодированном виде всю генетическую информацию любого живого организма, от человека до бактерий и вирусов, передаваемую от одного поколения  другому.

Нуклеиновые кислоты были впервые  выделены из клеток гноя человека и  спермы лосося швейцарским врачом и  биохимиком Ф.Мишером между 1869 и 1871. Впоследствии было установлено, что  существует два типа нуклеиновых  кислот: рибонуклеиновая (РНК) и дезоксирибонуклеиновая (ДНК), однако их функции долго оставались неизвестными.

В 1928 английский бактериолог Ф.Гриффит  обнаружил, что убитые патогенные пневмококки  могут изменять генетические свойства живых непатогенных пневмококков, превращая  последние в патогенные. В 1945 микробиолог  О.Эвери из Рокфеллеровского института  в Нью-Йорке сделал важное открытие: он показал, что способность к  генетической трансформации обусловлена  переносом ДНК из одной клетки в другую, а следовательно, генетический материал представляет собой ДНК. В 1940–1950 Дж.Бидл и Э.Тейтум из Станфордского  университета (шт. Калифорния) обнаружили, что синтез белков, в частности  ферментов, контролируется специфическими генами. В 1942 Т.Касперсон в Швеции и Ж.Браше в Бельгии открыли, что нуклеиновых кислот особенно много в клетках, активно синтезирующих  белки. Все эти данные наводили на мысль, что генетический материал –  это нуклеиновая кислота и  что она как-то участвует в  синтезе белков. Однако в то время  многие полагали, что молекулы нуклеиновых  кислот, несмотря на их большую длину, имеют слишком простую периодически повторяющуюся структуру, чтобы  нести достаточно информации и служить  генетическим материалом. Но в конце 1940-х годов Э.Чаргафф в США  и Дж.Уайатт в Канаде, используя  метод распределительной хроматографии  на бумаге, показали, что структура  ДНК не столь проста и эта молекула может служить носителем генетической информации.

Структура ДНК была установлена  в 1953 М.Уилкинсом, Дж.Уотсоном и Ф.Криком в Англии. Это фундаментальное  открытие позволило понять, как происходит удвоение (репликация) нуклеиновых  кислот. Вскоре после этого американские исследователи А.Даунс и Дж.Гамов  предположили, что структура белков каким-то образом закодирована в  нуклеиновых кислотах, а к 1965 эта  гипотеза была подтверждена многими  исследователями: Ф.Криком в Англии, М.Ниренбергом и С.Очоа в США, Х.Кораной  в Индии. Все эти открытия, результат  столетнего изучения нуклеиновых кислот, произвели подлинную революцию  в биологии. Они позволили объяснить  феномен жизни в рамках взаимодействия между атомами и молекулами.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.1 Типы и распространение нуклеиновых кислот.

Как мы уже говорили, есть два типа нуклеиновых кислот: ДНК и РНК. ДНК присутствует в ядрах всех растительных и животных клеток, где  она находится в комплексе  с белками и является составной  частью хромосом. У особей каждого  конкретного вида содержание ядерной  ДНК обычно одинаково во всех клетках, кроме гамет (яйцеклеток и сперматозоидов), где ДНК вдвое меньше. Таким  образом, количество клеточной ДНК  видоспецифично. ДНК найдена и  вне ядра: в митохондриях («энергетических  станциях» клеток) и в хлоропластах (частицах, где в растительных клетках  идет фотосинтез). Эти субклеточные частицы обладают некоторой генетической автономией.

Бактерии и цианобактерии (сине-зеленые  водоросли) содержат вместо хромосом одну или две крупные молекулы ДНК, связанные с небольшим количеством  белка, и часто – молекулы ДНК  меньшего размера, называемые плазмидами. Плазмиды несут полезную генетическую информацию, например содержат гены устойчивости к антибиотикам, но для жизни самой  клетки они несущественны.

Некоторое количество РНК присутствует в клеточном ядре, основная же ее масса находится в цитоплазме – жидком содержимом клетки. Б льшую ее часть составляет рибосомная РНК (рРНК). Рибосомы – это мельчайшие тельца, на которых идет синтез белка. Небольшое количество РНК представлено транспортной РНК (тРНК), которая также участвует в белковом синтезе. Однако оба этих класса РНК не несут информации о структуре белков – такая информация заключена в матричной, или информационной, РНК (мРНК), на долю которой приходится лишь небольшая часть суммарной клеточной РНК.

Генетический материал вирусов  представлен либо ДНК, либо РНК, но никогда  обеими одновременно.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1.2 Общие свойства нуклеиновых кислот

Молекулы нуклеиновых кислот содержат множество отрицательно заряженных фосфатных групп и образуют комплексы  с ионами металлов; их калиевая и  натриевая соли хорошо растворимы в  воде. Концентрированные растворы нуклеиновых  кислот очень вязкие и слегка опалесцируют, а в твердом виде эти вещества белые. Нуклеиновые кислоты сильно поглощают ультрафиолетовый свет, и  это свойство лежит в основе определения  их концентрации. С этим же свойством  связан и мутагенный эффект ультрафиолетового  света.

Длинные молекулы ДНК хрупки и легко  ломаются, например при продавливании  раствора через шприц. Поэтому работа с высокомолекулярными ДНК требует  особой осторожности.

1.2.1 Химическая структура.

Нуклеиновые кислоты –  это длинные цепочки, состоящие из четырех многократно повторяющихся единиц (нуклеотидов). Их структуру можно представить следующим образом:

Символ Ф обозначает фосфатную  группу. Чередующиеся остатки сахара и фосфорной кислоты образуют сахарофосфатный остов молекулы, одинаковый у всех ДНК, а огромное их разнообразие обусловливается тем, что четыре азотистых основания  могут располагаться вдоль цепи в самой разной последовательности.

Сахаром в нуклеиновых кислотах является пентоза; четыре из пяти ее углеродных атомов вместе с одним атомом кислорода  образуют кольцо. Атомы углерода пентозы обозначают номерами от 1 до 5. В РНК сахар представлен рибозой, а в ДНК – дезоксирибозой, содержащей на один атом кислорода меньше. Фрагменты полинуклеотидных цепей ДНК и РНК показаны на рисунке.

Поскольку фосфатные группы присоединены к сахару асимметрично, в положениях 3 и 5, молекула нуклеиновой кислоты имеет определенное направление. Сложноэфирные связи между мономерными единицами нуклеиновых кислот чувствительны к гидролитическому расщеплению (ферментативному или химическому), которое приводит к высвобождению отдельных компонентов в виде небольших молекул.

Азотистые основания – это плоские  гетероциклические соединения. Они  присоединены к пентозному кольцу по положению 1. Более крупные основания имеют два кольца и называются пуринами: это аденин (А) и гуанин (Г). Основания, меньшие по размерам, имеют одно кольцо и называются пиримидинами: это цитозин (Ц), тимин (Т) и урацил (У). В ДНК входят основания А, Г, Т и Ц, в РНК вместо Т присутствует У. Последний отличается от тимина тем, что у него отсутствует метильная группа (CH3). Урацил встречается в ДНК некоторых вирусов, где он выполняет ту же функцию, что и тимин.

1.2.2 Трехмерная структура.

Важной особенностью нуклеиновых  кислот является регулярность пространственного  расположения составляющих их атомов, установленная рентгеноструктурным  методом. Молекула ДНК состоит из двух противоположно направленных цепей (иногда содержащих миллионы нуклеотидов), удерживаемых вместе водородными связями между основаниями.

Водородные связи, соединяющие  азотистые основания противоположных цепей, относятся к категории слабых, но благодаря своей многочисленности в молекуле ДНК они прочно стабилизируют ее структуру. Однако если раствор ДНК нагреть примерно до 60°С, эти связи рвутся и цепи расходятся – происходит денатурация ДНК (плавление).

Обе цепи ДНК закручены по спирали  относительно воображаемой оси, как  будто они навиты на цилиндр. Эта  структура называется двойной спиралью. На каждый виток спирали приходится десять пар оснований.

1.2.3 Правило комплементарности

Уотсон и Крик показали, что образование  водородных связей и регулярной двойной  спирали возможно только тогда, когда  более крупное пуриновое основание  аденин (А) в одной цепи имеет своим  партнером в другой цепи меньшее  по размерам пиримидиновое основание  тимин (Т), а гуанин (Г) связан с цитозином (Ц). Эту закономерность можно представить  следующим образом:

Соответствие А-Т и Г-Ц называют правилом комплементарности, а сами цепи – комплементарными. Согласно этому правилу, содержание аденина в ДНК всегда равно содержанию тимина, а количество гуанина – количеству цитозина. Следует отметить, что две цепи ДНК, различаясь химически, несут одинаковую информацию, поскольку вследствие комплементарности одна цепь однозначно задает другую.

Структура РНК менее упорядочена. Обычно это одноцепочечная молекула, хотя РНК некоторых вирусов состоит  из двух цепей. Но даже такая РНК  более гибка, чем ДНК. Некоторые  участки в молекуле РНК взаимно  комплементарны и при изгибании  цепи спариваются, образуя двухцепочечные структуры (шпильки). В первую очередь  это относится к транспортным РНК (тРНК). Некоторые основания в  тРНК подвергаются модификации уже  после синтеза молекулы. Например, иногда происходит присоединение к  ним метильных групп.

1.2.4 Правила Чаргаффа

Правила Чаргаффа — система эмпирически  выявленных правил, описывающих количественные соотношения между различными типами азотистых оснований в ДНК. Были сформулированы в результате работы группы биохимика Эрвина Чаргаффа в 1949—1951 гг.

До работ группы Чаргаффа господствовала так называемая «тетрануклеотидная»  теория, согласно которой ДНК состоит  из повторяющихся блоков по четыре разных азотистых основания (аденин, тимин, гуанин и цитозин). Чаргаффу и  сотрудникам удалось разделить  нуклеотиды ДНК при помощи бумажной хроматографии и определить точные количественные соотношения нуклеотидов  разных типов. Они значительно отличались от эквимолярных, которых можно было бы ожидать, если бы все четыре основания  были представлены в равных пропорциях. Соотношения, выявленные Чаргаффом  для аденина (А), тимина (Т), гуанина (Г) и цитозина (Ц), оказались следующими: