Методы выделения нуклеиновых кислот из биологического материала

 

Стандартная методика получения чистого препарата основана на том, что ДНК является полярной молекулой и не растворяется в органических растворителях. Традиционно для выделения ДНК используется фенол-хлороформная экстракция. При перемешивании клеточного лизата и фенола формируются две фазы. ДНК находится в верхней (водной) фазе, а денатурированные белки — в нижней (органической) фазе [6]. Однако этот метод ориентирован на работу с такими агрессивными веществами, как фенол и хлороформ, и присутствуют стадии центрифугирования и жидкостной экстракции, которые нельзя автоматизировать.

4.2 Методы, позволяющие выделить ДНК и РНК одновременно

 

Известны  методы, согласно которым можно выделить одновременно и ДНК, и РНК из одного источника (см., например, [11]). Большинство известных методов является модификацией оригинальной процедуры Chirgwin с соавторами [12]. При этом используются сильные хаотропные агенты, такие как гуанидин тиоцианат и цезия три-флуороацетат для одновременного разрушения клеточных мембран и инактивации внутриклеточных рибонуклеаз (РНКаз). Лимитирующими факторами таких методик являются необходимость ультрацентрифугирования и большое время анализа (16–44 ч) [13, 14].

 

Методы  одновременного выделения ДНК и  РНК, в которых не присутствует операция центрифугирования, имеют преимущество еще и потому, что фенол действует как эффективный депротеинизирующий агент, разрушающий клетки и денатурирующий белки [6, 15]. Для эффективного отделения высокомолекулярной ДНК от РНК сначала производится фенольная экстракция, а затем две фенол-хлороформные экстракции для одно-временного удаления белков и липидов из раствора, содержащего нуклеиновые кислоты. С целью повышения выхода нуклеиновых кислот оптимизированы компоненты экстрагирующего буфера [16]. Например, определенный рН буфера (pH 7.9) в присутствии детергента (0.2 % додецилсульфат натрия) и относительно низкая концентрация соли (100 мМ LiCl) позволяют эффективно разделять нуклеиновые кислоты в водной фазе и диссоциировать белки. Кроме того, 10 мМ ЭДТА не позволяет образовываться белковым комплексам и об-разует хелатный комплекс с Mg₂+, ингибируя, та-ким образом, действие магний-зависимых нуклеаз

[17].

В методе, предложенном Krieg с соавторами [18], для отделения высокомолекулярной ДНК достаточно лизиса и процедуры  экстракции с ис-пользованием последующей этанольной преципитации. Время, необходимое для выделения вало-вых клеточных РНК и ДНК, составляет примерно

2 ч.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

5 Твердофазные методы выделения нуклеиновых кислот

5.1 Основные принципы твердофазных методов

 

В твердофазных методах выделения нуклеиновых кислот используются следующие процессы и принципы:

 

а) водородные связи с немодифицированной гидрофильной матрицей, обычно кварцем, в хаотропных условиях;

б) ионообмен в водном растворе, обычно с использованием анионообменников;

в) аффинность;

г) механизмы исключения по размеру.

 

Твердофазные системы, адсорбирующие нуклеиновые кислоты, — это частицы на основе кварца [7], стеклянные волокна, анионообменные носители [8], которые используются в хромато-графических сепарационных колонках. Эти носители применяются для выделения или очистки нуклеиновых кислот с высококонцентрированны-ми растворами хаотропных солей (йодид натрия, перхлорат натрия, гуанидин тиоцианата). Описано применение диатомовой земли в качестве сорбента, в этом случае связывание также происходит в присутствии хаотропной соли. Другие методы основаны на совместной детергенции с материала-ми, связывающими нуклеиновые кислоты, или на использовании твердого сорбента со связывающими нуклеиновые кислоты функциональными группами в сочетании с полиэтиленгликанами и солями в высокой концентрации.

 

Известна  группа методов пробоподготовки, основанная на использовании ионообменников типа Chelex, cорбирующих примеси, мешающие ПЦР [10]. Однако эти методы в большинстве случаев не могут удалить все возможные примеси, поэтому их применение довольно ограничено.

5.1.1 Метод выделения нуклеиновых кислот на стекле

 

Крайне  удобным является метод выделения  нуклеиновых кислот, предложенный Boom с соавторами [9]. Этот метод включает в себя стадию лизиса клеток сильным хаотропным агентом, который разрушает клеточные мембраны и инактивирует внутриклеточные РНКазы, и последующую сорбцию нуклеиновой кислоты на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное "молоко" и т. д.). Нуклеиновая кислота обратимо связывается со стеклом в присутствии высокой концентрации хаотропных солей (например, гуанидин хлорида, гуанидин тиоцианата). В таких условиях связывания белков с матрицей не происходит. Хаотропные соединения представляют собой вещества, нарушающие упорядоченную структуру воды и тем самым приводящие мембраны в со-стояние хаоса (например, мочевина, йодид натрия). Таким образом, помимо связывания, хаотропные агенты обеспечивают разрушение клеточных мембран и лизис клеток с последующим выходом нуклеиновой кислоты. Примеси отмываются хаотропной солью, а хаотропная соль — 80 % этанолом. Очищенная нуклеиновая кислота снимается со стекла буфером с низкой ионной силой. В настоящее время многие коммерческие фирмы предлагают для выделения нуклеиновых кислот колонки со стеклянной матрицей (например, Zymo Research и Promega). Методы, эксплуатирующие эти колонки, включают стадии центрифугирования или вакуумирования, однако занимают порядка 15 мин.

 

 

Табл. 1. Mагнитные частицы, используемые для выделения  ДНК, РНК и плазмидной ДНК [27]

 

Продукт	Диаметр	Полимерный состав /	Площадь	Вид	Производитель
	(мкм)	модификация	поверхности	нуклеиновой
		поверхности	(м2г–1)	кислоты
AGOWA®	5–10	Н. д.	Н. д.	ДНК, РНК	AGOWA, Герма-
mag					ния
Dynabeads®	1.05, 2.80	Полистирол	1–10	ДНК	Dynal, Норвегия
DNA					(переименована
					в Invitrogen)
GenoPrep™	Н. д.	Поверхность, покрытая	Н. д.	ДНК	GenoVision,
DNA magnetic		кварцем			Норвегия
beads					(Qiagen Compa-
					ny)
MagaZorb®	1–10	Целлюлоза	Пористая	ДНК/РНК,	Cortex Biochem
				пДНК	San Leandro,
					США
MagneSil	5–8.5	Силанизация оксида	27	ДНК/РНК,	Promega, США
		железа		пДНК
MagPrep®	~1	Силанизация оксида	14–25	ДНК	Merck KgaA,
Silica particles		железа			Германия
MagSi	1, 2, 5	Н. д.	Н. д.	ДНК/РНК	MagnaMedics,
					Германия
MGP	Н. д.	Стеклянная оболочка	Не пористая	ДНК/РНК	Roche Diagnostic
		без пор
M-PVA	0.5–1,	Поливиниловый спирт	Не пористая	ДНК/RРНК,	Chemagen
	1–3, 5–8			пДНК	Biopolymer
					Technology,
					Германия
Sicastar®-M	1.5, 6	Сополимер стирола	Не пористая	ДНК	Micromod
		и малеиновой кислоты			Partikel-
					technologie,
					Германия
SiMAG	0.5, 0.75,	Силанизация оксида	100	ДНК/РНК,	Chemicell, Гер-
	1	железа		пДНК	мания
SPHERO	1–2	Полистирол	Не пористая	ДНК	Spherotech, США
magnetic
particles

Примечание. Н. д. — нет данных

5.1.2 Метод на основе магнитной сепарации

 

Использование магнитных твердых носителей в биохимических и молекулярно-биологических процессах имеет много преимуществ по сравнению с немагнитными сепарационными методами. Обычно магнит прикладывается к стенке сосуда, содержащего образец, чтобы частицы агрегировали у стенки сосуда, а остаток образца можно было убрать. Таким способом можно отделять компоненты клеточного лизата, которые ингибируют ДНК-полимеразу и ПЦР-реакцию, например поли-сахариды, фенольные компоненты, гумус [19].

 

Для процесса выделения используются магнитные носители с иммобилизированными аффинными лигандами или изготовленные из биополимера, увеличивающего аффинность к нужной нуклеиновой кислоте. Магнитные носители имеются в продаже или могут быть изготовлены в лаборатории. Магнитные частицы производятся из различных синтетических полимеров, биополимеров, пористого стекла или на основе неорганических магнитных материалов, таких как оксид железа с модифицированной поверхностью. Особенно подходят для выделения суперпарамагнитные частицы, которые не взаимодействуют друг с другом в отсутствие магнитного поля. Эти частицы приобретают магнитный момент в сильном магнитном поле, но не сохраняют постоянного магнетизма, когда поле убирают. Если устранены магнитная агрегация и слипание частиц, то в течение реакции достигается суспензирование частиц и единообразная экстракция нуклеиновых кислот.

 

Для автоматического выделения нуклеиновых  кислот используются магнитные частицы со стеклянным покрытием [20]. Нуклеиновая кислота связывается со стеклянной поверхностью, затем связанная с частицами она проходит те же стадии экстракционного процесса, что и в методике Boom: после серии отмывок в пробе остается нуклеиновая кислота, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации, его можно воспроизвести на роботизированных пипеттирующих рабочих станциях. Однако возможны потери продукта вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце [21].

 

Валовые ДНК и РНК выделяются с помощью  одних и тех же магнитных частиц. Чтобы отделить РНК от ДНК, РНК уничтожается до стадии сепарации ДНК. Наилучшим вариантом является добавление РНК-азы или щелочи. Наоборот, РНК может быть выделена при разрушении ДНК дезоксирибонуклеазой (ДНК-азой).

Например, первичный метод очистки плазмиды — отделение плазмидной ДНК (пДНК) от хромосомной ДНК и клеточной РНК бактерии-хозяина. Stadler с соавторами [22] показали, что даже в случае многокопийной плазмиды пДНК составляет не более 3 % клеточного лизата и большинство контаминантов заряжены отрицательно (РНК, комплементарная ДНК (кДНК), эндотоксин), сходны по размеру (кДНК, эндотоксин) и по гидрофобности (эндотоксин). Были разработаны методы для наработки очищенного лизата, но они не способны убрать белки и липиды. Также воз-можен щелочной лизис бактериальных клеток с последующей нейтрализацией [23]. Протоколы очистки лизатов отличаются друг от друга концентрациями солей, объемами, рН, температурой, продолжительностью стадий. Эти методы эксплуатируют разницу в характеристиках ковалентной закрытой кольцевой пДНК и фрагментов хромосомной ДНК при денатурации и ренатурации [24]. Например, суперпарамагнитные частицы, модифицированные мультивалентным катионным полиэтиленимином, используются для выделения пДНК из очищенного бактериального лизата [25].

 

Доступны  различные магнитные частицы  с оптимизированными буферами и  протоколами для лабораторий  и автоматических систем (табл. 1 и 2). Обычно к магнитным носителям  прилагаются связывающие растворы, с помощью которых осуществляется селективное связывание нуклеиновых кислот. Например, для связывания вирусных нуклеиновых кислот можно использовать как вирусные белки, так и комплементарные ДНК- или РНК-последовательности [26].

В табл. 2 приведены некоторые магнитные частицы с иммобилизованным на их поверхности олигодеокситимидином для эффективного и быстрого выделения высокоочищенной матричной РНК (мРНК) из культур эукариотических клеток или выделения валовой РНК [28]. Метод выделения основан на гибридизации последовательности олигодеокситимидина стабильным полиаденилированным 3-концом эукариотической мРНК. Длина комплементарной последовательности — 20– 30 олигонуклеотидов. Эта последовательность либо напрямую ковалентно связывается с поверхностью частицы, либо не напрямую, через биотинилированые олигонуклеотиды, и с помощью взаимодействия между покрытыми стрептавидином частицами. Корпорации CPG и Dynal (в настоящее время Invitrogen) производят MPG® и Dynabeads® с иммобилизованными биотинилированными олигонуклеотидами, однако и другие фирмы предлагают модифицированные стрептавидином частицы, которые могут быть использованы для выделения мРНК, как описывается, например, в инструкции к "mRNA isolation kit with MagneSphere®"фирмы Promega.

 

Почти все магнитные частицы (кроме MagaCell™ oligodT30 и Sera-Mag oligo-(dT)30) продаются вместе с оптимизированными буферными  системами и готовыми протоколами. Число производителей магнитных  частиц постоянно растет, поэтому  для поставленной задачи легко подобрать  удобный метод.

 

Табл. 2. Некоторые магнитные частицы, используемые для выделения матричной РНК [27]

 

Продукт	Диаметр	Полимерный состав /	Площадь	Производитель
	(мкм)	модификация	поверхности
		поверхности	(м2г–1)
BcMag® mRNA	1, 5	Силанизация оксида	Н. д.	Bioclone, США
		железа
BioMag®	1	Силанизация оксида	100	Bangs Lab., Fisher, США,
oligo(dT)20		железа		или Polysciences, США
Dynabeads®	1.05, 2.8	Полистирол	1–10	Dynal, Норвегия (пере-
oligo(dT)25				именована в Invitrogen)
μMACS oligodT	0.05	Декстран	Не пористая	Miltenyi Biotech, Герма-
				ния
MagaCell™	1–10	Целлюлоза	Пористая	Cortex Biochem, США
oligodT30
MagneSphere®	1	Покрытый стрептави-	100–150	Promega, США
		дином магнетит
MPG® streptavidin	5	Пористое боросили-	60	PureBiotech, США
oligo(dT)25		катное стекло
M-PVA-	Различный	Поливиниловый спирт	Не пористая	Chemagen AG, Германия
oligo(dT)30	(0.5–1;
	1–3; 5–8)
mRNA-cellulose	1–10	Целлюлоза	Н. д.	Scipac Ltd., Великобрита-
				ния
Nucleo-Adembeads	0.1–0.5	Полимеры	100	Ademtech, Франция
Scigen M100	~3.5	Целлюлоза	10	Vector Lab., США
oligo(dT)30
Sera-Mag	1	Полистирол	Не пористая	Seradyn, С
oligo(dT)30