Методы выделения нуклеиновых кислот из биологического материала

Однако  позднее были опубликованы данные [3], свидетельствующие о возможности наблюдения сходных ``ДНК-подобных'' структур при исследовании методом СТМ чистой, свежесколотой поверхности пирографита. Возникновение таких структур объясняется чувствительностью СТМ к электронным свойствам поверхности - происходит визуализация доменных стенок пирографита [4]. Эти результаты, а также слабая воспроизводимость и отсутствие безусловно необходимых контрольных экспериментов в первых работах по СТМ-визуализации ДНК вызывали сомнения в применимости методов зондовой микроскопии для исследования макромолекул.

Существенное  изменение ситуации произошло в  1992 г., когда были опубликованы первые надежные и воспроизводимые результаты исследования ДНК методом атомно-силовой микроскопии (АСМ) [5,6]. Таким образом, прошло более пяти лет с момента создания атомно-силового микроскопа (1986 г.) и более десяти лет существования зондовой микроскопии, прежде чем был достигнут определенный успех в применении метода к исследованию биологических объектов. В то же время методы зондовой микроскопии весьма успешно применялись в течение этих десяти лет для исследований структуры поверхности твердых (кристаллических) тел. За эти годы возникло понимание, что потенциал возможностей зондовой микроскопии в исследованиях биологических объектов может быть реализован лишь при решении в каждом конкретном случае основной экспериментальной задачи: определения адекватной методики препарирования образцов.

6.5.1  Основные методики препарирования образцов для зондовой микроскопии нуклеиновых кислот

Универсальной методики приготовления образцов для  решения широкого спектра задач  зондовой микроскопии пока не существует, поэтому используемые методики определяются спецификой задачи, т.е. являются методиками ``на конкретный случай''. Применительно  к исследованиям нуклеиновых  кислот во многих случаях бывает важно, чтобы макромолекулы адсорбировались  на подложку в расправленном состоянии. Для успешного исследования необходимо также, чтобы исследуемые молекулы достаточно прочно фиксировались на подложке. В противном случае, при исследованиях в жидкой среде, молекулы будут увлекаться зондом в процессе сканирования; при исследовании на воздухе, силы, действующие на молекулу при высыхании капли препарата на подложке, также будут увлекать адсорбируемые структуры, приводя к неоднородному (с образованием агрегатов) поверхностному распределению исследуемых объектов. Ниже рассмотрим основные методики, позволяющие зафиксировать молекулы нуклеиновых кислот на поверхности в расправленном состоянии.

Первые  надежные результаты исследования ДНК  методом атомно-силовой микроскопии  были получены в том случае, когда  изучаемые структуры наносили из капли рабочего раствора (раствора буфера, водно-спиртовой среды и  т.п.) на поверхность слюды, модифицированной ионами двух- (и более) валентных  металлов [5,6]. Эти ионы, по-видимому, служат связующими мостиками между отрицательно заряженной слюдой (в водных растворах) и отрицательно заряженными фосфатными группами молекулы ДНК. Модификация слюды может предшествовать процессу адсорбции макромолекул - в этом случае свежесколотую слюду помещают для предварительной обработки на некоторое время (минуты, часы) в раствор, содержащий катионы металлов, затем промывают (водой, водным раствором этанола и пр.) и высушивают. После этого на модифицированную поверхность наносят рабочий раствор с исследуемыми структурами. Другой подход - добавление солей металлов непосредственно к рабочему раствору - позволяет исключить этап предварительной обработки слюды (препарат наносят непосредственно на поверхность свежего скола). После высыхания капли рабочего раствора образцы, как правило, подвергают дополнительной промывке.

В работе [7] методом АСМ проводили сравнительный анализ процесса адсорбции макромолекул ДНК на слюду из раствора, как с катионами металлов, так и без них. Было показано, что во втором случае адсорбированные молекулы нестабильны в процессе промывки образцов и при сканировании. Кроме того, АСМ-изображения макромолекул характеризуются большим количеством запутанных и перекрученных участков, тогда как при присутствии в растворе катионов металлов и применении предшествующей сканированию процедуры промывки образцов молекулы ДНК фиксируются на поверхности подложки в расправленном состоянии.

Авторы  работы [8] исследовали методом АСМ в жидкостной ячейке в реальном масштабе времени обратимое осаждение молекул ДНК на слюду при различных параметрах рабочего раствора. Было показано, что адсорбция объектов на поверхность подложки и величина силы адгезии существенно зависят от концентрации связующих катионов (оптимальное значение около 2 мМ для Zn ²⁺) и pH среды (оптимальное значение около 7,5).

На  сегодняшний день использование  катионов металлов для связывания ДНК  с подложкой является, пожалуй, наиболее распространенной методикой приготовления  образцов при АСМ-исследованиях, что  объясняется ее простотой и высокой  воспроизводимостью результатов.

Другая  широко используемая методика химической модификации подложки для стабилизации молекул нуклеиновых кислот на поверхности - это силанизация слюды [10]. Процесс силанизации существенно не изменяет топографических особенностей поверхности слюды - она остается достаточно гладкой, в то же время улучшается связь макромолекулы с модифицированной подложкой. В работе [11] при проведении АСМ-исследований нуклеиновых кислот (ДНК, двунитевой рибонуклеиновой кислоты (РНК)) в качестве подложки использовали поверхность слюды, химически модифицированную 3-аминопропилтриэтоксисиланом (APTES). Модификация включала ковалентную привязку аминогрупп молекул APTES к слюде, степень модификации контролировали с помощью АСМ, и выбирали таким образом, чтобы шероховатость получаемой поверхности не затрудняла идентификацию исследуемых структур. Это обстоятельство (необходимость контроля степени шероховатости модифицированной подложки) незначительно усложняет методику.

Было  показано [12], что этот подход препарирования образцов достаточно эффективен в рутинных исследованиях распределения молекул нуклеиновых кислот по длинам. Представленные авторами результаты совпадали с данными электронной микроскопии (исследовались молекулы двунитевой РНК ретровируса), при этом было отмечено, что при равенстве разрешающих способностей важным преимуществом АСМ является существенно менее сложная методика приготовления образцов.

Была  продемонстрирована возможность использования  модифицированной APTES слюды при проведении исследований как на воздухе, так  и в водной среде - в обоих случаях величина адгезии молекул нуклеиновых кислот к подложке позволяла осуществлять сканирование в контактном режиме. В работе [13] осуществляли сканирование одного и того же участка поверхности с адсорбированными макромолекулами на воздухе и в воде, при этом во втором случае отмечалось увеличение разрешающей способности (примерно в три раза), что может быть связано с исключением негативного влияния капиллярных сил. Капиллярные силы увеличивают силовое воздействие зонда на образец, что вызывает дополнительные деформации макромолекулы, ее разрушение или нестабильность в процессе сканирования, и приводит к уменьшению разрешающей способности.

Другие  исследователи также сообщают, что, если АСМ-исследования проводятся либо в сухой газовой атмосфере (иногда для уменьшения относительной влажности  температуру рабочей атмосферы  повышают до 60-100^°С [14]), либо в жидкостной ячейке [15,16], то влияние капиллярных сил уменьшается, что увеличивает достигаемое пространственное разрешение. Применение режима прерывистого контакта [17,18] также позволяет исключить влияние капиллярных сил; микроскопия прерывистого контакта позволяет сегодня достичь разрешения (при проведении исследований в жидких средах), необходимого для визуализации витков двойной спирали ДНК [19].

На  пути подбора адекватного подхода  к приготовлению образцов может  оказаться полезным накопленный  за десятилетия исследований багаж  методик препарирования образцов электронной  микроскопии. В упрощенном варианте многие из этих методик могут применяться  и для решения задач зондовой микроскопии. Так, модифицированный метод  Кляйншмидта [20,21] (метод белковой пленки) дает хорошие результаты при использовании гидрофобных подложек [22]. Недостатком метода может служить то, что комплексообразование молекул нуклеиновых кислот с белковой пленкой (часто используют пленку цитохромов C) затрудняет исследование взаимодействия этих молекул с другими белками, что ограничивает круг решаемых задач.

Для фиксации развернутых молекул ДНК  на поверхности подложки применяют  также бензилдиметилалкиламмоний  хлорид (BAC) [23,24] - широко используемый в электронной микроскопии реагент, представляющий собой катионное поверхностно-активное вещество (ПАВ). BAC в малых концентрациях (около 5×10^-5%) добавляют непосредственно в раствор, содержащий макромолекулы, перед нанесением препарата на поверхность слюды. Вследствие свойств ПАВ, на поверхности капельки, наносимой на подложку, формируется стабильная пленка молекул BAC (со связанными с ней молекулами ДНК), которая распределяется по поверхности слюды и стабилизируется за счет сил электростатического взаимодействия. Использование других ПАВ (в малых концентрациях) также способствует стабилизации молекул нуклеиновых кислот на поверхности слюды. Так, в работе [25] для разворачивания ДНК на поверхности, успешно применили 2,4,6-трис(диметиламинометил)фенол (DMP-30) и хлорид цетилпиридиния (CP), представляющие собой, соответственно, неионное и катионное ПАВ.

К недостаткам  метода с применением ПАВ можно  отнести некоторую поверхностную  неоднородность получаемых образцов, что обусловлено неконтролируемостью  процессов формирования пленки и  комплексообразования с исследуемыми макромолекулами. Удачным дополнением  метода может служить использование  методики Ленгмюра-Блоджетт: формирование на границе раздела фаз жидкость/газ  пленки амфифильных молекул и  последующее контролируемое перенесение  ее на поверхность твердой подложки.

В работе [26] для иммобилизации молекул ДНК применили другую методику, сходную с традиционной для электронной микроскопии. Макромолекулы адсорбировали на поверхность слюды, сверху напыляли слой углерода. После этого на углерод приклеивали стальную пластинку, слюду удаляли, и открытой для сканирования оказывалась внутренняя (обращенная прежде к слюде) поверхность углеродной пленки с жестко закрепленными в ней макромолекулами. Шероховатость поверхности углеродной пленки составляла, по оценкам авторов, единицы ангстрем и допускала однозначную идентификацию отдельных молекул ДНК. Авторы работы отмечают высокую стабильность приготовленных образцов - макромолекулы не разрушались при больших силах воздействия зонда, результаты не зависели от среды исследования (эксперименты проводились как на воздухе, так и в жидкости), длительное хранение не влияло на качество образцов. Недостаток этого метода состоит в его относительной экспериментальной трудоемкости.

Успехи  применения атомно-силовой микроскопии  к исследованию молекул нуклеиновых  кислот позволили достичь прогресса  и при проведении подобных экспериментов  методами сканирующей туннельной микроскопии. Хорошие результаты были получены при  СТМ-исследовании молекул ДНК, адсорбированных  на химически модифицированных поверхностях металлов [27]. Химическая модификация включала ковалентную связь химически поляризуемых групп тиолов с чистой поверхностью металла. Адсорбция ДНК осуществлялась за счет кулоновского взаимодействия молекулы с плотно упакованной мономолекулярной пленкой тиолов, ориентированной положительными функциональными группами к молекуле ДНК. Характерной особенностью представленных в работе [28] изображений молекул ДНК (приготовленных по описываемой методике) является отрицательный контраст (при движении над молекулой туннельная игла опускается ниже, чем при движении над поверхностью подложки), связанный, по-видимому, со слабой проводимость макромолекулы.

Другой  перспективный подход к исследованию макромолекул методами СТМ - применение низкотоковой туннельной микроскопии [29] с рабочим диапазоном туннельного тока менее 1 пА. В этом случае экспериментальные результаты [30] свидетельствуют о возможности визуализации молекул ДНК, адсорбированных на поверхности диэлектрической подложки (слюды). Транспорт заряда в системе зонд-образец-подложка осуществляется за счет проводимости ультратонкой пленки воды, покрывающей поверхности образца и подложки при проведении исследований в условиях контролируемой относительной влажности. Оптимальное значение последней для подобных экспериментов составляет 60- 65%.

Т.о. спектр применяемых методик препарирования образцов нуклеиновых кислот для  СЗМ весьма широк. В то же время  стоит отметить, что описанные  методики разработаны для исследования свободных молекул ДНК, поэтому априори неизвестно адекватны ли они для изучения, например, взаимодействия нуклеиновых кислот с белками или поверхностно-активными веществами. Упомянем также, что в литературе по СЗМ описаны, в основном, лишь исследования двунитевых молекул нуклеиновых кислот: РНК и ДНК, имеющих двойную спираль, и практически отсутствуют данные об исследовании однонитевых молекул (которые сложнее зафиксировать на подложке в расправленном состоянии).

6.5.2  Применение зондовой микроскопии для исследования структуры и свойств молекул нуклеиновых кислот и их комплексов

При подборе адекватной методики приготовления  образцов сканирующий зондовый микроскоп  представляет собой удобный и  надежный прибор для исследования свойств  биологических структур на молекулярном уровне. Убедительным доказательством  этого утверждения могут служить  результаты работ, посвященных исследованию конформационных свойств молекул  нуклеиновых кислот и их комплексов с белками, ПАВ и т.п.

Авторы  работы [31] исследовали влияние специфических лигандов (дистамицина и микрогонотропена-6b) на конформационные свойства нескольких типов молекул ДНК методом АСМ прерывистого контакта. Результаты исследований не только обеспечили визуальное доказательство влияния данных лигандов на конформацию ДНК, но и позволили сделать определенные количественные оценки, основанные на анализе представленных авторами гистограмм распределения расстояния между концами ДНК.

В работе [32] исследовали специфическое взаимодействие РНК-полимеразы из Escherihia coli с ДНК, содержащей lP_L промотор. Образованные комплексы были визуализированы методом АСМ, на полученных изображениях наблюдались молекулы ДНК с РНК-полимеразой, локализованной на расстоянии 4/9 от одного из концов. Проводили анализ структуры комплекса РНК-полимеразы и ДНК как в открытых комплексах, связанных с промотором (OPCs), так и в стабильных элонгационных комплексах (С15) с образованным 15-нуклеотидным транскриптом. Было показано, что в области прикрепления РНК-полимеразы происходит изгиб молекулы ДНК, причем средний угол изгиба для OPCs и С15 составлял 54±31^° и 92±37^°, соответственно. На основании обнаруженного различия в значениях средних углов изгиба для OPCs и C15 авторы делают вывод, что процесс транскрипции сопровождается изменением структуры комплекса РНК-полимеразы с ДНК, обусловленной конформационными изменениями полимеразы.

Возможность АСМ-визуализации молекулярных процессов  продемонстрирована в работе [33] на основе последовательного анализа образования неспецифичных комплексов молекулы ДНК и РНК-полимеразы в реальном масштабе времени. Схема эксперимента включала в себя адсорбцию макромолекул ДНК на слюду из 10 мM HEPES буфера в присутствии ионов магния (1-10 мM MgCl₂), затем следовали промывка и высушивание образцов в эксикаторе. После этого образцы помещали в жидкостную ячейку микроскопа, начинали процесс сканирования, а затем в раствор вводили РНК-полимеразу. Было показано, что образование комплексов белок-ДНК наблюдается уже через несколько секунд после добавления полимеразы, что свидетельствует о сохранении нативной конформации РНК-полимеразы и ДНК в процессе приготовления образцов и проведения исследований. Эти результаты демонстрируют возможность использования зондовой микроскопии для исследования процессов, ответственных за распознавание и сборку макромолекулярных комплексов в физиологических условиях.