Үлгідегі ферменттердің анықталуы. Есептеулер

                                                                                      ↓                                  ↓

                                                                                      R                                 R

рН мәнінің жоғары көрсеткішінде алтыншы карбоксильді  топ пратон жоғалтады, нәтижесінде электрлі бейтарап дипольді ион түзіледі немесе  цвиттер – ион НN+ CНRСОО-              Н N +- СН – СООН + ОН +         →      Н N+ - СН – СОО-

                                                           ↓                                                                                 ↓

                                       R                                                     R

 Егер рН көтеріле берсе екінші протонды жоғалтып НNСНRСОО- ионы түзіледі.

    НN + - СН – СООН + ОН +                   Н N+ - СН – СОО-

                R                                                            R

20 амин қышқылы көрінетін спектрді жұтпайды, олардың үшеуі ғана , триозин, триптофан, және фенилаланин ултракөгілдір  сәулесін жұтатындығы анықталған. Белоктардың көпшілігінің құрамында тирозин қышқылының қалдығының болатыны белгілі. Тез және ыңғайлы әдіс спектрофотометрмен 280 нм – де жұтылуын өлшеу арқылы ерітіндіде белоктың бар жоғын анықтауға болады.[10, 5 ].

1.4 Ферменттер.

             Белоктардың негізгі қасиеттерінің бірі катализдік ролі. Барлық  биолгиялық катализаторларлар – ферменттердің табиғаты белоктар, олар жасушадағы химиялық реакцияны ондаған, жүздеген есе жылдамдатады. «Катализ» термині биохимияда химиялық өндірістегіден  аз қолданылмайды.

       

 

 

             2. Орындалатын жұмыстың әдістемесі.

              Саралау , анализ жасау әдістерін  таңдағанда зерттеу обьектісінің ерекшеліктерін ескере отырып нақты дәлдікті қажет ететін түрі таңдалуы қажет. Анализ үшін бірнеше үлгі керек. Анализ нәтижесінде алынып отырған зат өнімдерінің ортақ көрсеткіші алынады. Бұл әсіресе ет өнімдеріне анализ жасағанда қолданылуы керек. Себебі олардың құрамының күрделігіне , құрамындағы компоннентердің құрылымы мен ерекшеліктеріне байланысты. Сондықтан азғана массасын өлшегенде өте ұсақ етіп ұнтақтап, алынған массаны жақсылап араластырған дұрыс.

           2.1 Ет құрамындағы белокты анықтау.

           Практикада белоктың сандық құрамын анықтау үшін концентрацияның өзгеруіне тікелей байланысты белок ерітіндісінің физикалық қасиетіне байланыстылығын ескереміз. Ең алдымен зерттеу обьектісінде белоктың болуын азот санымен анықтайды немесе амин қышқылдарының қалдықтарымен анықталады.

               Фотометриялық әдіспен белок құрамын анықтау. Етте және ет өнімдерінде белоктың болуын Кьельдал әдісі бойынша фотометриялық әдіс , органикалық заттардың минералдануы нәтижесінде түзілген аммиак санымен анықтауға болады.

            Жұмыстың орындалу тәртібі. Минералдану үшін 0,4-0,5 г зерттеу обьектісін алып оны Кьельдаль колбасына саламыз. Колбаға 1-2 г калий сульфатын құйып, 15-20 мин күшті жалынды отта қыздырамыз, бөлме температурасында суытып 4 – 5 мл 30 пайыздық сутегінің асқан тотығын құямыз және тұнық ерітінді болғанша қыздыруды жалғастырамыз. Минералданғаннан кейін  колбаны суытып 250 мл  колбаға салып дистиллденген суды құямыз да араластырамыз. Алынған минералды ерітіндінің  5- мл – ін 100 мл колбаға құйып тағы да дистелденген су қосамыз.

             Түсті реакция жасау үшін 1 мл екінші рет ерітілген ерітіндіден пробиркаға  құйып 5 мл 1 және 2 – ші реактивтерді  қосамыз. Бірдей уақытта  салыстырмалы бақылау жасайтын минерализат жасаймыз. 30  мин өткен соң ерітіндінің оптикалық тығыздығын толқын ұзындығы 625 нм болатын спектрометрде немесе қызыл фильтрлі спектрометрде анықтаймыз. Салыстырмалы бақылауға арналған минерилизатпен салыстырамыз. Ерітіндінің бояу түсі 1 сағ – қа дейін сақталады. Түсті реакция жасау үшін температура  20  градустан төмен болмауы керек.

              Алынған оптикалық тығыздық өлшемі  бойынша график сызып отырып  азот концентрациясын анықтаймыз.

              Реактивтер: Тығыздығы 1840 кг\м3 күкірт қышқылын қолданамыз; 1М тұз қышқылы, сутегінің асқан тотығы, аммоний сульфаты, кальций хлораты, натрий гидрооксиді, фенол, натрий тиосульфаты, натрий гипохлориты, калий иодиді, натрий карбонаты.

№ 1 реактивті дайындау үшін 10 г фенол, және 0,05 гр натрий нитропруссидін 1000 мл – лік колбада дистиллденген суда ерітеді.

№ 2 реактив дайындау үшін 5 г натрий гидрооксидін 1000 мл колбада дистилденген суда ерітіп суытып алған соң 0,45 г\ л есебімен натрий гипохлоритін құяды. Белгісіне дейін дистиллденген суды құйып, дайын болған реактивті 2 – айға шейін мұздатқышта сақтауға болады.

           График құру. График құру үшін стандарт ерітінді сульфат амоний ерітіндісін қолданады:  тұрақты массаға келгенге дейін 60  градус температурада  алдын ала кептірілген 0,236 г  сульфат аммонийды  500 мл-лік  колбаға саламыз және дистиллденген суда ерітеміз. Бұл ерітінді стандарт ерітінді деп аталады, себебі  1 мл – де 0,1 мг  азот бар. 100 мл – лік  колбаларға  стандарт ерітіндіден (мл) : 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0. Құямыз да дистиллденген сумен белгілі бір өлшеміне дейін құйып ерітінді аламыз.

                Түсті реакция жасау үшін 1 мл – лік пробиркаларға ерітінді құйып , бірінші реактивтен 5 мл , екінші реактивтен 5 мл құйып араластырамыз. 30 мин. соң толқын ұзындығы 625 нм спектрофотометрде  үш рет қатар оптикалық тығыздығын өлшейміз. Әр жолы жаңа дәстүрлі ерітінді дайындалады.

                Алынған үш жолғы зерттеу нәтижесімен  график құрылады. Абсцисс осьне  азот концентрациясын (мкг \ мл), ал  ординат осьне  сәйкес келетін оптикалық тығыздықтары жазылады. [ 7 ].

        

 

 

                2.2  Ет құрамындағы майды анықтау.

               Ет құрамындағы майды анықтау үшін  оның органикалық ерітінділерде  еруін білу керек және қайнау  температурасы төмен еріткіштерді алады, себебі майдан ажыратып алуда көп қиыншылық кездестірмейді. Әсіресе көбінде күкірт эфирін, хлороформды, немесе дихлорэтанды қолданады. Ет өнімдерінен майды бөліп алу липидтердің басқа да компоненттермен байланысына , судың болуына , обьекті құрылымына және  құрамындағы майы бар материалдарға байланысты. Ұлпада судың болу болмауы материалдан диффузия құбылысы арқылы еріткішке өтуімен анықталады. Жоғары температурада қыздыру әдісін қолданғанда зерттеуге алынған материалды ұсақтайды. 

Хлороформмен майды экстрогендеу.  Бұл әдіс майды ет өнімдерімен еттен хлороформ арқылы үзіліссіз сілкіп кептіру арқылы жүреді.

Жұмысты орындау тәртібі: 2г ұсақталып өлшеніп алынған ет және ет өнімдерін 4 г сусыз натрий сульфатымен араластырып  колбаға салады. (15 мл хлороформмен шайып отырып) содан соң зертханалық шайқағышта 1 сағат қалдырып , қағаз фильтрде сүзу жұмыстарын жүргізеді. 5 мл фильтратты  алдын ала кептірілген өлшенген бюкске салып 105 градус Селсии температурада тұрақты массасына дейін кетіреді Суыған соң өлшеп жазып алынады. Реактивтер техникалық хлороформ және натрий сульфаты.  [ 13 ].

              2.3. Ет және ет өнімдері құрамындағы амин қышқылдарын   анықтау.

             Ет сияқты күрделі қоспада  аминқышқылдарының салыстырмалы  сандық мөлшерін анықтау ; мыс белок гидролизаты, өте қиын міндет қояды. Аминқышқылдар қоспасы құрамын анықтау ионалмасу храмотография  әдісін қолдана бастағаннан кейін ғана мүмкіншілік туды. Бұл әдіс бірте – бірте жетілдіріліп қазіргі уақытта нақты дәл  көрсеткіш беріп жоғары   деңгейде автоматтандырылды.

           Белок гидролизатынан амин қышқылдарын  анықтау. Бұл әдіс амин қышқылдары  молекулаларын конц, күкірт қышқылымен өңдегенде түзілген   өнімдер арасындағы реакцияларға негізделген.

Жұмысты орындау тәртібі.: 4 г ет және ет өнімдерін 100 мл кем емес центрофугалық стаканға салып үстіне 4 мл дистиллденген су құямыз және тиянақты ұсақтаймыз. Етті майсыздандыру үшін 40 мл дейін ацетон ерітіндісін құйып  араластырамыз. Қоспаны комната температурасында  30 мин ұстап 20  мин центрофугада  41,7 с -1 жылдамдықпен айналдырамыз. Сұйық бөлімін құйып алып тұнбаны ацетоннан тазарту үшін  80 0С –де булы баняда  2 сағат бойы қыздырамыз.Амин қышқылдарын бөліп алу үшін сілтілік гидролиз жасаймыз. ( Кьельдаль колбасында)   Гидролизатты  ұқыпты өте сақтықпен 3 М  күкірт қышқылы ерітіндісінде  бейтараптап барып  рН- ты 6,5 – 7,0 – ге дейін әлсіз ерітінді аламыз. рН – ты индикатормен анықтайды. Осыдан соң дистиллденген су құйып  қоспаны қалың қағаз сүзгі арқылы тұнық болғанынша  өткіземіз.

              Түсті реакция жасау үшін 100 мл-лік колбаға келесідегідей ретпен ерітіндіні тамызамыз: 1 мл зерттеу препаратын, 0,5 мл п – диметиламинобензальдегидті  (жылдам  сілкілеу арқылы), 0,2 мл 2 пайыздық натрий нитратын және 28 мл концентрлі күкірт қышқылын. Ерітіндіні бөлме температурасында бояуы шығуы үшін 30 мин қалдырып , содан кейін 50 пайыздық этонол белгіленген мөлшерге дейін құямыз. Бірдей уақытта екі негізгі және екі бақылау жасайтын немесе салыстыратын ерітінділер әзірлейміз.  Көгілдір бояудың түзілу жылдамдығын (КФК-3)  қызыл жарықфильтрлі  спектрометрде өлшейміз. Әр амин қышқылының толқын ұзындығын анықтау үшін арнайы ерітінді дайындалып нақты толқын ұзындығы есептеледі.Графикте оптикалық тығыздық өлшемі бойынша түсті реакцияға алынған  сұйық көлеміндегі амин қышқылдары концентрациясын табады. Ал, график салу үшін 50 гр ампулада сақталынған таза амин қышқылдарын үш рет өлшеп алып оны 20 мл 3 М натрий гидрооксидінде ерітеді. Амин қышқылдарының концентрациясы 1 мл 1 мг – ға тең болады. Алынған мәліметтер бойынша график сызамыз. Ординат осьне оптикалық тығыздығын,ал абцисс осьне амин қышқылдар концентрациясын орналастырамыз.

№ 1 Таблица. Стандарт ерітінді концентрациясы.

Амин қышқылдар мөлшері,мкг	Дәстүрлі ерітінді мөлшері,мл	Су мөлш,        мл	Амин қышқылдар мөлш, мкг	Дәстүрлі ерітінді мөлшері,мл	Су мөлш,        мл
100	0,1	0,9	400	0,4	0,6
200	0,2	0,8	500	0,5	0,5
300	0,3	0,7	600	0,6	0,4

Реактивтер:  Ацетон, 2,5 пайыздық натрий гидрооксиді, 2,5 пайыздық п- диметиламинобензальалдегид, 2% натрий нитраты, тығыздығы 1640 кг\ м3 тұз қышқылы, 50% тік этонол ерітіндісі, индикатор, 0,1% тік фенолороттың спиртегі ерітіндісі және аминқышқылдары.

                2.4 Ферменттер мөлшерін анықтау.

                Осы ерітіндідегі ферменттердің  қаншалықты мөлшерін олардың катализдік белсенділіктерін өлшеу арқылы анықтауға болады. Бұл үшін міндетті түрде мына жағдайларды білу керек.

• Катализдік реакцияның жалпы стихиометриясын
• Металл ионы немесе коферменттерге қажеттілік мүмкінділігін
• Фермент белсенділігінің субстрат және коофактор (Km өлшемі) концентрациясына  байланыстылығын
• Фермент белсенділігіне pH-тың әсерін
• Ферменттердің тұрақты және жоғарғы белсенділігі болатын температураны [1]. Ферменттердің болу мөлшерін анықтауды саралау қалыпты жағдайда жүзеге асады. Қалыпты жағдай дегеніміз pH-тың тиімді мәні және субстраттың концентрациясы қаныққан болуы. Әлбетте реакция өнімінің түзілу жылдамдығын өлшеу нақты жүргізіледі. Өнімнің түзілу реакция жылдамдығын химиялық немесе спектрометриялық әдіспен өлшеуге болады. Неғұрлым қолайлы өлшеу әдісі  спектрометриялық  әдіс болып саналады.  [ 25 ].

Түсті реактивті дайындау. 10г п–диметиламинобензальдегидті 35мл хлорлы қышқылға НСІО үзіліссіз араластыра отырып дайындалады.Алынған ерітіндіні 65 мл пропонолмен араластырады.Ерітіндіні қолданатын күні ғанадайындайды.[7,20 ]. Ферменттердің белсенділігін анықтау. Ферменттердің белсенділігі үлгідегі ферменттер концентрациясына байланысты.Неғұрлым концентрациясы жоғары болатын болса , соғұрлым белсенділігі де жоғары болады. Концентрациясы 150мг\ 100гболатын болса белсенділіктерінің жоғары болатынына тиімді көрсеткіш,ал егер концентрациясы одан төмен болатын болса белсенділіктері нашар болады[8].

          3. ЭКСПЕРИМЕНТ НӘТИЖЕСІ.

      Ет және  субөнімдерінің химялық құрамын  зерттегенде анализ жасау ережесен қатаң сақтау керек.

 

            3.1 Белок құрамы.      Белок құрамын мына формуламен есептейді.  Х ,   Мұнда- х белоктың құрамы,%  с- азоттың құрамы, мкг/мл; өлшенген масса, г; 100 – минирализаттың екінші рет сұйытқандағы көлемі; 250- бірінші реттік сұйытқандағы көлемі, мл; 1 – түсті реакцияның ерітінді көлемі, мл; 6,25-белоктың қайта есептеу коэффиценті. Азот концентрациясына байланысты  оптикалық тығыздығының салыстырмалы     графигі.   2 кесте

Азоттың  мөлшері	1	1,5	2	2,5	3	3,5	4	4,5	5
Оптикалық тығыздық  625нм	0	0,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,7	0,8