ГМО в продуктах харчування

- виділення  ДНК із стандартних зразків  складу з досліджуваних зразків  здійснюється одночасно одним  методом з допомогою СТАВ (чи набору реактивів "ДНК-сорб-С").

8.2.3. Набір реактивів "АмплиСенс ГМ соя FRT" :

- призначений  для ідентифікації генно-інженерно-модифікованої сої в харчових продуктах і рослинній сировині методом ПЛР в реальному часі;

- аналіз є  проведенням трьох ПЛР в одній пробірці, для кожної з яких використовуються специфічні праймери і мічений флуоресцентними барвниками зонд;

- в двох реакціях  виявляються послідовності ДНК,  специфічні для перегляду 35 S з  вірусу мозаїки цвітної капусти  і термінатора NOS in Agrobactetium tumefaciens, третя призначена для ампліфікації ендогенної ДНК, специфічної для усіх ліній сої;

- виділення  ДНК здійснюється з допомогою  СТАВ або набору реактивів  "ДНК-сорб-С".

8.2.4. Набір реактивів "АмплиСенс ГМ кукурудза FRT" :

- призначений для ідентифікації генно-інженерно-модифікованої кукурудзи в харчових продуктах і рослинній сировині методом ПЛР в реальному часі;

- аналіз є  проведенням трьох ПЛР в одній пробірці, для кожної з яких використовуються специфічні праймери і мічений флуоресцентними барвниками зонд;

- в двох реакціях  виявляються послідовності ДНК,  специфічні для промотора 35 S з  вірусу мозаїки цвітної капусти  і термінатора NOS з Agrobactetium tumefaciens, третя призначена для ампліфікації  ендогенної ДНК, специфічної для усіх ліній кукурудзи;

- виділення ДНК здійснюється з допомогою СТАВ або набору реактивів "ДНК-сорб-С".

8.2.5. Виділення ДНК з використанням набору реактивів "ДНК-сорб-С" :

- буфер для  реагенту, що лізирує, і розчин  для відмивання 1 прогріти при  64 °C до повного розчинення кристалів;

- в кожну пробірку внести по 400 мкл буфера для реагенту, що лізирує, і по 17 мкл реагенту, що лізирує, ретельно перемішати;

- інкубувати  при 64 °C 1 година, періодично струшуючи  на вортекс; 

- центрифугировать 5 хвилин при 12000 - 14000 о./хв.; - відібрати і перенести надосадочную рідину в об'ємі 200 - 350 мкл в чисті пробірки;

- центрифугировать 5 секунд при 5000 о./хв.;

- ретельно ресуспендировать  сорбент на вортекс, в кожну  пробірку додати по 25 мкл ресуспендованого  сорбенту, перемішати на вортекс, залишити в штативі на 10 - 15 хвилин, перемішуючи кожних 2 хвилини;

- центрифугировать 1 хвилину при 5000 о./хв., видалити  супернатант; 

- додати по 300 мкл розчину для відмивання 1, перемішати на вортекс до повного  ресуспендирования сорбенту, центрифугировать 1 хвилину 5000 о./хв.;

- видалити супернатант; - додати по 500 мкл розчину для  відмивання 2, перемішати на вортекс  до повного ресуспендирования  сорбенту, центрифугировать 1 хвилину  при 10000 - 12000 о./хв., відібрати супернатант;

- повторити  процедуру відмивання, відібрати  супернатант повністю, помістити  пробірки в термостат 64 °C на 5 - 10 хвилин для підсушування сорбенту, при цьому кришки пробірок  мають бути відкриті;

- додати по 50 мкл ТЕ-буфера для елюції ДНК,  перемішати на вортекс;

- помістити  в термостат 64 °C на 5 - 8 хвилин, періодично струшуючи на вортекс; 

- центрифугировать 1 хвилину при 12000 - 14000 о./хв.;

- розчин ДНК  зберігати впродовж 1 тижня при  температурі від 2 до 8 °C і впродовж 1 року - при температурі мінус 20 °C.

8.3. Методи кількісного визначення сої лінії 40-3-2, кукурудзи лінії GA 21, кукурудзи лінії NK 603, кукурудзи лінії MON 863, розроблені Центром "Біоінженерія" РАН.

8.3.1. Набори реактивів для кількісного визначення сої лінії 40-3-2, кукурудзи лінії GA 21, кукурудзи лінії NK 603, кукурудзи лінії MON 863 методом ПЛР в реальному часі :

- до складу  кожного набору входять 2 пробірки  матричної реакційної суміші, 1 пробірка  з термостабільною полимеразой, 8 пробірок із стандартними розведеннями рекомбінантною ДНК;

- реакційна  суміш на одну пробу містить  9,25 мкл матричної реакційної суміші, 0,75 мкл термостабільної полимеразы, 32,0 мкл деіонізованої води, кінцевий  об'єм кожної проби - 50 мкл; 

- реакційну  суміш розлити в пробірки по 42 мкл на пробу;

- додати 8 мкл  розчину ДНК в наступному порядку  - контроль без ДНК, ДНК 0%, ГМО  0,5%, ГМО 100%, досліджувані зразки;

- центрифугировати;

- умови ампліфікації : 94 °C - 9 хв. - 1 цикл(72 °C - 1 хв.) - 40 циклів;

- набори реактивів  оптимізовані для роботи на ампліфікаторах типу ABI Prism 7000/7700.

8.3.2. Метод виділення ДНК із застосуванням технології Wizard, Promega:

- навішування  досліджуваного продукту масою  100 міліграм помістити в микроцентрифужную  пробірку типу Эппендорф місткістю  1,5 мл;

- додати 300 мкл  - буфера I (50 мМ Трис HCl, pH - 8,0; 10 мМ  ЭДТА; 50 мкг/мл панкреатичної РНКазы  вільної від ДНКаз, 3 М гуанідин  тіоціанату) при кімнатній температурі; 

- розтерти пробу  в пробірці товкачиком до гомогенного  стану; 

- додати 400 мкл  буфера II (2% додецилсульфат натрію, 0,2 М NaOH) і перемішати на вортекс;

- інкубувати  при 65 °C 30 хвилин, перемішати на  вортекс, охолодити до кімнатної  температури; 

- додати 400 мкл  буфера III (5 М ацетат калію, pH 4,5), перемішати  на вортекс 2 хвилини; 

- центрифугировать 10 хвилин при 13000 о./хв.;

- надосадок  відібрати і перенести в чисту  пробірку типу Эппендорф місткістю  1,5 мл, додати смолу Wizard MaxiPreps з  розрахунку 100 мкл смоли на 200 мкл  надосадочной рідини і перемішати  на вортекс; 

- за допомогою стерильного шприца місткістю 2 мл прокачати суміш через микроцентрифужную колонку;

- стерильним  шприцом місткістю 2 мл прокачати  через микроцентрифужную колонку  2 мл промивального буфера (0,2 М  NaCl, 20 мМ Трис HCl, pH - 8,0, 5 мМ ЭДТА  змішати в співвідношенні 5:7 з 96% етанолом);

- помістити  мікроколонку в микроцентрифужную  пробірку типу Эппендорф місткістю  1,5 мл;

- центрифугировать 1 хвилину при 13000 о./хв.;

- помістити  мікроколонку в чисту микроцентрифужную  пробірку типу Эппендорф місткістю  1,5 мл;

- додати в  колонку 100 мкл деіонізованої  води, нагрітої до 65 °C, центрифугировать 15 секунд при 13000 о./хв.;

- виміряти концентрацію  розчину ДНК і довести її  до 10 нг/мкл; 

- розчин ДНК  зберігати при мінус 20 °C.

8.4. Кількісне визначення сої лінії 40-3-2, кукурудзи ліній GA 21, MON 810, T - 25, Bt - 176, Bt - 11 з використанням наборів реагентів GeneScan Analytics GmbH.

8.4.1. Набори реактивів для визначення сої лінії 40-3-2 (GMOQuant Roundup Ready(TM) Soy), кукурудзи лінії Bt - 176 (GMOQuant Maximizer(TM) Bt 176 corn), кукурудзи лінії Bt - 11 (GMOQuant Bt - 11 Corn), кукурудзи лінії MON 810 (GMOQuant YieldCard(TM) MON 810), кукурудзи лінії T - 25 (GMOQuant LibertyLink(TM) T25 Corn), кукурудзи лінії GA 21 (GMOQuant Roundup Ready(TM) GA 21 Corn) :

- використовується  реакційна суміш, що дозволяє  амплифицировать ділянку ендогенної  ДНК, характерною для кукурудзи  або сої, і реакційна суміш,  що дозволяє амплифицировать  ділянку рекомбінантної ДНК; 

- кожна реакційна  суміш містить відповідні праймери  і зонд, що мітиться флуоресцентним барвником FAM, специфічний для ГМО і VIC, специфічний для сої або кукурудзи;

- інтенсивність  флуоресценції вимірюють за допомогою  приладів типу ABI - PRISM 7000, iCycler iQ і  аналізують із застосуванням  програмного забезпечення приладів.

8.4.2. Метод виділення ДНК за допомогою набору реагентів "GENESpin" :

- набір "GENESpin" призначений для виділення геномної  ДНК з харчових продуктів; 

- досліджуваний  зразок харчового продукту гомогенізувати, додати лизируюший буфер, що  містить денатуруючі агенти і детергенты;

- лізат центрифугировать;

- додати зв'язуючий  буфер і етанол для створення  оптимальних умов осадження ДНК  на фільтрі із спеціально підібраним  силікагелем; 

- промити буфером  для видалення потенційних інгібіторів  ДНК-полимеразы;

- ДНК елюювати  водою або буфером, зберігати  при мінус 20 °C.

8.5. Методи кількісного визначення сої лінії 40-3-2, кукурудзи лінії MON 810 розроблені ГУ ВНІІ сільськогосподарській біотехнології РАСХН :

8.5.1. Принцип методів :

- для кількісного визначення ГМО одночасно проводяться дві незалежні реакції в одній пробірці, одна реакція дозволяє виявляти ДНК сої або кукурудзи, інша - послідовність, специфічну для сої лінії 40-3-2 або кукурудзи лінії MON 810;

- для виявлення  ДНК сої або кукурудзи використовується зонд, мічений барвником R6G, для виявлення генетичної конструкції - барвником FAM або ROX залежно від типу приладу;

- інтенсивність  флуоресценції вимірюють за допомогою  приладів типу АНК-32, ABI - PRISM 7000, iCycler iQ і аналізують із застосуванням програмного забезпечення приладів;

- визначення  відсоткового вмісту ГМО здійснюється  з використанням калібрувальних  зразків (До), які є суміші ДНК  рослини дикого типу (0%) і ДНК  ГМО (100%) в певному процентному  співвідношенні, різниця значень порогових циклів двох реакцій для калібрувальних зразків використовується для побудови калібрувальної прямої. За допомогою калібрувальної прямої розраховується відсотковий вміст ДНК ГМО в аналізованих пробах.

8.5.2. Метод виділення ДНК "СОРБ-ГМО" :

- подрібнені навішування зразків перенести в одноразові микроцентрифужные пробірки об'ємом 1,5 мл або 2,0 мл;

- внести в  кожну пробірку по 600 мкл буфера, що лізирує, і 10 мкл реагенту, що лізирує, ретельно перемішати;

- інкубувати 50 - 60 хвилин при 65 °C, періодично перемішуючи на вортекс;

- внести в  кожну пробірку по 500 мкл хлороформу, інтенсивно перемішати, центрифугировать 10 хвилин при 12 000 - 14 000 о./хв.;

- верхню водну  фазу в об'ємі 300 мкл акуратно, не захоплюючи хлороформ і  міжфазний шар, перенести в пробірку з сорбентом, інтенсивно перемішати на вортекс до повного ресуспензирования сорбенту, інкубувати при кімнатній температурі 10 хвилин, періодично струшуючи;

- центрифугировать  суспензію при 10 000 о./хв. 1 хвилину,  видалити супернатант; 

- додати до осаду 500 мкл промивального розчину А, перемішати на вортекс до максимального ресуспензирования сорбенту, інкубувати при кімнатній температурі 2 - 3 хвилини, періодично струшуючи;

- центрифугировать  при 7 000 о./хв. 30 секунд, видалити супернатант;

- додати до  осаду 500 мкл промивального розчину  б, перемішати на вортекс до  максимального ресуспензирования  сорбенту;

- центрифугировать  суспензію при 7 000 о./хв. 30 секунд, видалити супернатант; 

- додати до  осаду 500 мкл промивального розчину  В, перемішати на вортекс до максимального ресуспензирования сорбенту;

- центрифугировати при 7 000 о./хв. 30 секунд, видалити супернатант;

- помістити  пробірки з відкритими кришками  в термостат при температурі  65 °C на 5 хвилин для випару рідини;

- до сухого осаду додати 100 мкл ТІ буфера, перемішати на вортекс, інкубувати 10 хвилин при температурі 65 °C, перемішуючи кожних 2 хвилини;

- центрифугировать  при 12 000 - 14 000 о./хв. 2 хвилини; 

- чисту надосадочную  рідину перенести в чисту пробірку  об'ємом 0,5 - 1,5 мл, не захоплюючи сорбент.

8.5.3. Порядок проведення досліджень :

- узяти необхідну  кількість пробірок з реакційною  сумішшю з тест-системи з розрахунку N 8, де N - кількість аналізованих  зразків; 

- після розморожування  реакційної суміші центрифугировать пробірки 30 - 60 секунд при більше 4000 о./хв.;

- внести в  пробірки по 2 мкл досліджуваних  зразків і в останню чергу  калібрувальних зразків сої або  кукурудзи в двох повторах, перемішати  багатократним пипетированием, помістити  пробірки в амплификатор;

- програма ампліфікації  для сої: 10 хв./95 °C, 20 сек./95 °C, 50 сек./62 °C, зйомка 50 циклів, 25 °C - зберігання;

- програма ампліфікації  для кукурудзи: 10 хв./95 °C, 20 сек./95 °C, 50 сек./60 °C, зйомка 50 циклів, 25 °C - зберігання.

8.6. Для визначення ГМО рослинного походження допустиме використання тест-систем з технічними характеристиками, аналогічними вказаним вище і дозволеними для використання в установленому порядку.

 

 

 

ВИСНОВКИ 

 

Питання про перспективу  використання генної інженерії при  вирощуванні сільськогосподарської сировини продовжує викликати серйозні суперечки серед дослідників і широких верств споживачів. Серед позитивних аргументів — підвищена врожайність, екологічні переваги, захист від шкідників. З іншого боку — непевність у безпечності нових технологій.

 

Україні необхідно на державному рівні визначити політику щодо використання та поширення ГМО.

 

Останнім часом точиться дискусія про великі масштаби несанкціонованого  поширення та використання в Україні  трансгенних сортів і трансгенної харчової продукції, але жодних цифр, які б це підтвердили, немає. Відсутній закон, який би захищав населення. Існує Постанова Кабінету Міністрів України 1998 року про реєстрацію використання трансгенних речовин.

 

Потрібно на законодавчому  рівні визначитися щодо принципів регулювання ГМО в Україні: додержуватись суттєвої еквівалентності (як у США, Канаді, країнах Латинської Америки) чи принципу "запобігання ризикам" (як того вимагає Картахенський протокол і як встановлено в ЄС). І лише після цього вводити чи не вводити обов'язкове маркування ГМ продукції. Можливо, потрібно ухвалити Закон про біобезпеку в новій редакції, використавши досвід ЄС. В ЄС вже розроблені стратегічні плани дії на період до 2025 р.: "Рослини для майбутнього" — щодо місця рослин в житті сучасної людини, де, зокрема, обговорюється питання збільшення продуктивності рослин, зміни якості, збереження їх різноманіття.

 

Разом з тим визнано, що трансгенні рослини можуть потрапляти у навколишнє середовище, тому потрібно відповідально підходити до їх вирощування, моніторити гени. Для цього слід створити спеціальні лабораторії.