ГМО в продуктах харчування

- провести операцію  розмітки матриці, щоб поєднати  центри вимірювальних зондів  з центрами плям грат в зображенні, для цього вибрати опцію "Аналіз", "Розмітка матриці";

- розмітка розпочинається  з малювання прямокутника, бічні  сторони якого проходять через центри вузлів крайніх стовпців, для цього треба клацнути лівою кнопкою миші в центрі лівої верхньої плями/осередку, потім, тримаючи кнопку натиснутою, перемістити праву нижню вершину прямокутника, що з'явився, в центр нижнього правого вузла;

- в результаті попередньої  розмітки на екрані з'явиться  чотирикутник з внутрішніми лініями,  розташованими рівномірно, відповідно  до заданого числа стовпців  матриці, щоб завершити розмітку і закрити діалогове вікно, треба натиснути клавішу "Прийняти";

 

- після завершення  базової розмітки провести автоматичну  корекцію положення зондів, для  цього в меню вибрати опцію  "Налаштування/Автоматичне підстроювання";

- для аналізу результатів  треба вибрати опцію меню "Аналіз" - "Показати результати", після закінчення вимірів програма надає можливість підготовки і роздруку протоколу випробувань, для цього треба вибрати опцію меню "Файл" і потім "Заповнити протокол", після цього з'явиться вікно з формою для заповнення, після того, як вона буде заповнена, натиснути кнопку "Вихід".

6.8. Інтерпретація результатів :

- поява реєстрованого  комп'ютерною програмою оптичного  сигналу в одній, декількох  або в усіх п'яти зонах гібридизації, що містять иммобилизованные  олигонуклеотиды, вказує на присутність  рекомбінантної ДНК, що свідчить про наявність ГМО рослинного походження в аналізованому зразку;

- відсутність реєстрованого  оптичного сигналу в усіх п'яти  гибридизационных зонах, що містять  иммобилизованные олигонуклеоїди, вказує на відсутність рекомбінантної ДНК, що свідчить про те, що аналізований зразок не має ГМО рослинного походження;

- поява оптичного сигналу  в зоні гібридизації при використанні  негативного контролю ампліфікації  свідчить про отримання псевдопозитивного  результату, причиною може бути  забруднення реактивів і/або устаткування, в цьому випадку необхідно обробити поверхні лабораторних столів і устаткування розчином 1H соляної кислоти, замінити реактиви на свіжоприготовані і повторити аналіз;

- відсутність оптичного  сигналу при використанні позитивного контролю ампліфікації свідчить про отримання псевдонегативного результату, причиною можуть бути втрата активності одного з компонентів реакційної суміші для амПЦР і/або гібридизації із застосуванням ферментного аналізу на біологічному мікрочіпі, в цьому випадку необхідно замінити реактиви на свіжоприготовані і повторити аналіз.

 

VІІ. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНЫЙ АНАЛІЗ  МЕТОДОМ ПЛР В РЕАЛЬНОМУ ЧАСІ

 

7.1. Для виявлення ГММ і МГМА в харчових продуктах методом ПЛР в реальному часі використовують наступні матеріали, устаткування, реактиви :

1) амплификатор з оптичною  приставкою типу Rotor Gene - 3000, ABI Prism 7000, iCycler IQ або вітчизняні аналоги; 

2) комп'ютер, сумісний  з програмним забезпеченням амплификаторов  з оптичною приставкою;

3) оптичні 96-лункові планшети типу MicroAmp;

4) оптичних кришки  типу MicroAmp;

5) оптично прозорі  адгезивні плівки;

6) термостат, що підтримує  температуру 45 °C, для пробірок  об'ємом 1,5 мл;

7) центрифуга із швидкістю  обертання ротора до 12000 о./хв. для  пробірок місткістю 1,5 і 0,5 мл типу "эппендорф";

8) підтрушувач вібраційний  типу "вортекс" із швидкістю  обертання до 3000 о./хв.;

9) очок/маска захисні; 

10) холодильник побутовий  електричний; 

11) морозильна камера, що забезпечує температуру (- 20) °C або нижче; 

12) гомогенізатор типу "SilentCrusher" або інших моделей;

13) ступка фарфорова  з товкачиком;

14) пінцет медичний;

15) ножиці медичні;

16) скальпель медичний;

17) ваги лабораторні загального призначення 2-го класу точності;

18) дистилятор;

19) аналізатор потенціометр;

20) опромінювач бактерицидний  настінний; 

21) дозатори зі змінним  об'ємом дозування : 0,2 - 2,0 мм3 з  кроком 0,01 мм3, 0,5 - 10,0 мм3 з кроком 0,01 мм3, 2 - 20 мм3 з кроком 0,01 мм3, 20 - 200 мм3 з кроком 0,1 мм3, 100 - 1000 мм3 з кроком 1 мм3, 2 - 10 см3 з кроком 0,1 см3;

22) пробірки типу "эппендорф"  місткістю 1,5 мл;

23) пробірки типу "эппендорф"  для ПЦР місткістю 0,5 мл;

24) наконечники полімерні  об'ємом 1 - 200 мкл; 

25) наконечників полімерні об'ємом 200 - 1000 мкл;

26) рукавичок гумових; 27) колб плоскодонні конічні різній місткості;

28) циліндрів скляні  мірні лабораторні місткістю  25, 100, 1000 см3;

29) воронок скляних; 

30) штативів для пробірок  об'ємом 1,5 і 0,5 мл;

31) комплект N 2 (модифікований)  реагентів для ампліфікації ДНК "Набор для виділення ДНК з ферментних препаратів, культур стартерів і заквашувальних, БАД до їжі";

32) реактиви:

- тритон Х-100,

- гуанідину гидрохлорид, 

- ЕДТА (етилендиамінтетраоцетова кислота),

- додецилсульфат натрію, - суспензія двоокису кремнію,

- фенол водонасичений, - хлороформ водонасичений, 

- спирт етиловий ректифікований,

- ацетат амонія, - протеиназа K,

- магнію хлорид,

- калію хлорид,

- водний розчин дезоксинуклетидтрифосфатов (0,1 М),

- креозоловый червоний,

- термостабільна ДНК-полімераза,

- олія вазелінова, - трис-ацетат,

- крижана оцтова кислота, 

- агароза для електрофорезу, 

- бромистий этидий,

- вода деіонізована.

7.2. Допускаються до використання устаткування, інструменти і матеріали аналогічного призначення інших типів, дозволені до застосування в установленому порядку і з характеристиками, що забезпечують проведення досліджень відповідно до цього документу.

7.3. Виділення ДНК ГММ і МГМА із заквашувальних і стартерів культур, БАД, ферментних препаратів і харчових продуктів здійснюють відповідно до п. п. 3.13 - 3.17 справжніх Методичних вказівок.

7.4. ПЛР в реальному часі здійснюють з використанням модифікованого комплекту N 2 реагентів для ампліфікації ДНК "Набір реагентів для виявлення селективних маркерів генетично модифікованих мікроорганізмів". Модифікація передбачає використання в реакційній суміші не лише праймерів, але і флуоресцентно-мічених зондів, а також використання контрольної ДНК ГММ з відомою концентрацією в декількох десятиразових розведеннях.

7.5. Флуоресцентно-міченими зондами є олигонуклеотиды, амплифицируемой послідовності-мішені комплементу, що утримують на 5 '- кінці флуорофор - донорфлуоресцентного випромінювання, а на 3 '- кінці - його акцептор (гаситель).

           Наростання флуоресцентного світіння спостерігають після фізичного відокремлення флуорофору і гасителя; відокремлення флуорофору і гасителя відбувається при гібридизації з амплифицируемым фрагментом ДНК за рахунок 5 '- экзонуклеазной активності Taq -полимеразы, що руйнує зонд після його гібридизації з амплифицируемой послідовністю. Ріст реєстрованого флуоресцентного світіння відбувається пропорційно наростанню числа ампликонов.                  

Це дозволяє реєструвати  накопичення продуктів ампліфікації в реальному часі, а порівняння кінетики флуоресценції ДНК-стандартів і досліджуваного зразка - визначати відносну концентрацію ДНК в зразку.

7.6. Зонди синтезують на автоматичному олигонуклеотидном синтезаторі типу ASM102U фосфитамидным методом в режимі DMT - on, використовуючи фосфорамидиты і полімерний носитель типу Glen Reseach. Для введення на 3 '- кінець зонду мітки диметиламінофенілазобензойной кислоти (DABCYL) в якості гасителя флуоресценції використовують фазу 3 '- Dabcyl CPG (типу Glen Reseach) в стандартному режимі синтезу. Введення на 5 '- кінець зонду флуорофору - донора флуоресценції - здійснюють автоматичним синтезом, при використанні 6-карбоксифлуоресцеїн-амідіта (FAM -фосфорамідит).              

Первинне очищення зондів здійснюють на колонках типу Poly- Pac, з  подальшим додатковим очищенням в полиакриламидном гелі.

7.7. Для ПЛР в реальному часі використовують ферменти Taq -полимеразу Termo - Star, або Taq -полимеразу HotRescue, інактивовані антитілами, або полимеразу AmpliTaq Gold, що мають виражену 5 '- экзонуклеазной активністю.

7.8. Для проведення ПЛР в реальному часі використовують систему, що складається з термоциклера (амплификатора) і флуоресцентного детектора продуктів ПЛР в реальному часі.

7.9. Концентрацію ДНК ГММ в зразку визначають шляхом порівняння кінетики флуоресценції ДНК-стандартів в діапазоні розведень контрольних препаратів (10-кратних розведень контрольною ДНК відомої концентрації) і досліджуваного зразка.

7.10. Ампліфікацію проводять за двоступінчатою програмою, що об'єднує стадії відпалу і элонгации в один етап; кінцева концентрація зондів в реакційній суміші - до 200 нМ.                 

Реакцію проводять в  реакційній суміші об'ємом 50 мкл, що включає : десятиразовий реакційний буфер, адаптований  до використовуваного типу полимеразы; 250 мкМ кожного з 4 дезоксирибонуклеотидтрифосфатов; 300 нМ кожного з праймерів; 200 нМ флуоресцентно-міченого зонду; 5 ед. Taq -полімерази.  

Ампліфікацію проводять за програмою:

1) 1 цикл - 10 хв. - 95 °C;

2) 50 циклів: 20 з - 95 °C, 1 хв. - 65 °C.

7.11. Для постановки ПЛР в реальному часі у використовуваному приладі для ампліфікації створюють спеціальний протокол відповідно до інструкцій по користуванню; після завершення створення протоколу перевіряють наявність в списку режиму компенсації базової лінії ПЛР і відмічають використовувані флуоресцентні барвники. Контрольну ДНК використовують у відомих розведеннях певної концентрації (стандартах); кількість повторів стандартів визначає відповідно до керівництва по експлуатації приладу.

7.12. Детекцию результатів ПЛР в реальному часі роблять автоматично у рамках створеного протоколу в графічному і цифровому виді. Автоматичний аналіз даних відбувається таким чином: останні 95% даних, зібраних на кожному кроці, фільтруються середньозваженим методом. Для експериментів по ампліфікації вибирають цикли базової лінії для кожної кривої (зразки) індивідуально з урахуванням загального оптимального значення порогу.  По значеннях стандартів обчислюють стандартну криву, на основі якої визначають концентрації ДНК ГММ в досліджуваних пробах.

 

VIII. МЕТОДИ ІДЕНТИФІКАЦІЇ І КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ ГМО З ВИКОРИСТАННЯМ ТЕСТ-СИСТЕМ

 

8.1. Метод кількісного визначення генно-инженерно-модифицированной сої і кукурудзи з використанням наборів "TaqMan GMO Soy Detection Kit" і "TaqMan GMO Maize Detection Kit" :

- набори реактивів  призначені для кількісного визначення  в харчових продуктах генно-инженерно-модифицированной  кукурудзи або сої;

- метод заснований  на ПЦР в реальному часі;

- амплифицируется  ділянка ендогенної ДНК, характерною  для усіх ліній кукурудзи або сої, і ділянка рекомбінантної ДНК в ході двох незалежних реакцій з використанням відповідних праймерів і зондів, мічених флуоресцентним барвником;

- реєстрація  флуоресценції барвників здійснюється  приладами типу ABI - PRISM 7000, Rotor Gene 3000 і аналізується з використанням програмного забезпечення приладів;

- відносний  зміст ГМО в харчовому продукті  розраховується з використанням  стандартних зразків складу шляхом  порівняння результатів виміру  флуоресценції барвника FAM, специфічного  для ГМО, з результатами виміру флуоресценції барвника VIC, специфічного для усіх ліній сої або кукурудзи;

- виділення  ДНК із стандартних зразків  складу і з досліджуваних зразків  здійснюється одночасно одним  методом з допомогою СТАВ або  набору реактивів "ДНК-сорб-С".

8.2. Метод ідентифікації і кількісного визначення ГМО з використанням наборів "Ампликвант ГМ соя", "Ампликвант ГМ кукурудза", "АмпліСенс ГМ соя FTR", "АмпліСенс ГМ кукурудза FTR", розроблених ФГУН Центральний НДІ епідеміології Роспотребнадзора.

8.2.1. Набір реактивів "Ампликвант ГМ соя":

- призначений  для кількісного визначення генно-інженерно-модифікованої сої;

- метод заснований  на ПЛР в реальному часі;

- амплифікується ділянка ендогенної ДНК, характерною для усіх ліній сої, і ділянка рекомбінантної ДНК, промотора 35 S з вірусу мозаїки цвітної капусти, в ході двох незалежних реакцій з використанням відповідних праймерів і зондів, мічених флуоресцентним барвником;

- реєстрація  флуоресценції барвників здійснюється  приладами типу ABI - PRISM 7000, Rotor Gene 3000 і аналізується з використанням програмного забезпечення приладів;

- відносний  зміст ГМО в харчовому продукті  розраховується з використанням  стандартних зразків складу шляхом  порівняння результатів виміру  флуоресценції барвника FAM, специфічного для ГМО, з результатами виміру флуоресценції барвника VIC, специфічного для усіх ліній сої;

- виділення  ДНК із стандартних зразків  складу і з досліджуваних зразків  здійснюється одночасно одним  методом з допомогою СТАВ або  набору реактивів "ДНК-сорб-С".

8.2.2. Набір реактивів "Ампликвант ГМ кукурудза":

- призначений  для кількісного визначення генно-инженерно-модифицированной  кукурудзи; 

- метод заснований  на ПЛР в реальному часі;

- амплифицируется  ділянка ендогенної ДНК, характерною  для усіх ліній кукурудзи, і ділянка рекомбінантної ДНК, промотора 35 S з вірусу мозаїки цвітної капусти, в ході двох незалежних реакцій з використанням відповідних праймерів і зондів, мічених флуоресцентним барвником; - реєстрація флуоресценції барвників здійснюється приладами типу ABI - PRISM 7000, Rotor Gene 3000 і аналізується з використанням програмного забезпечення приладів; - відносний зміст ГМО в харчовому продукті розраховується з використанням стандартних зразків складу шляхом порівняння результатів виміру флуоресценції барвника FAM, специфічного для ГМО, з результатами виміру флуоресценції барвника VIC, специфічного для усіх ліній кукурудзи;