ГМО в продуктах харчування

- в полипропиленовую пробірку  місткістю 1,5 мл вносять 100 мкл  гомогенізованого зразка, додають  100 мкл розчину 1, перемішують на  вихровому змішувачі впродовж 3 - 5 сек.;

- пробірки інкубують при температурі 55 °C впродовж 40 хв.;

- додають 200 мкл (рівний  об'єм) розчину 2, перемішують на  вихровому змішувачі впродовж 10 сек. і центрифугируют при кімнатній  температурі ( 18 - 25 °C) впродовж 5 хв. при 10000 - 12000 о./хв. (10000 - 13000 g);

- відбирають верхню (водну)  фазу і вносять її в полипропиленовую  пробірку місткістю 1,5 мл, в цю  пробірку додають 200 мкл (рівний  об'єм) розчину 3;

- перемішують на вихровому  змішувачі впродовж 3 - 5 сек. і  центрифугируют при кімнатній  температурі 2 хв. при 10000 - 12000 о./хв. (10000 - 13000 g). Відбирають водну фазу (200 мкл) і вносять її в полипропиленовую пробірку місткістю 1,5 мл, в цю пробірку додають 40 мкл розчину 4 і 720 мкл (3 об'єми) розчину; перемішують на вихровому змішувачі впродовж 3 - 5 сек.;

- інкубують при кімнатній температурі впродовж 40 хв.;

- центрифугируют при  кімнатній температурі ( 18 - 25 °C) впродовж 15 хв. при 12000 о./хв. (13000 g); супернатант  видаляють; 

- в пробірку вносять  100 мкл розчину 6;

- центрифугируют впродовж 1 хв. при кімнатній температурі при 12000 о./хв. (13000 g); супернатант видаляють; осад сушать на повітрі впродовж 10 хв.;

- розчиняють осад в  50 мкл розчину 7; отримані зразки  ДНК використовує для подальшого  аналізу. 

5.19. Проведення ПЛР здійснюють з використанням комплекту N 2 реагентів для ампліфікації ДНК "Набір реагентів для виявлення селективних маркерів генетично модифікованих мікроорганізмів".

Комплект N 2 реагентів  для ампліфікації ДНК включає:

- ПЛР-суміш 1 (реакційний буфер, суміш олигонуклеотидных праймерів і дезоксинуклеозидтрифосфатов) - 8 пробірок по 1300 мкл;

- ПЛР-суміш 2 (термостабільна ДНК-полимераза) - 4 пробірки (200 мкл);

- олія мінеральна - 8 пробірок  по 1300 мкл; 

- позитивні контрольні зразки ДНК (плазмідна ДНК з клонованим специфічним фрагментом відповідних маркерних генів) - 4 пробірки по 30 мкл;

- негативні контрольні  зразки (плазмидная ДНК pET - 9) - 4 пробірки  по 30 мкл. 

5.20. Проведення ПЛР з використанням комплекту N 2 включає наступні етапи:

- перед початком роботи виймають з морозильної камери комплект реагентів для ампліфікації (окрім ПЛР-суміші 2), розморожують вміст пробірок при кімнатній температурі, ретельно перемішують на вихровому змішувачі впродовж 10 сек. і поміщають усі пробірки в холодильник; - амплификационные пробірки місткістю 0,2 (чи 0,5) мл маркірують відповідно до маркіровки аналізованих зразків, пробірки для позитивного контрольного зразка ДНК маркірують як ПК, для негативного контрольного зразка - ОКИ;

- робочий розчин для проведення реакції ампліфікації готують в кількості, достатній для аналізу усіх проб (при аналізі N зразків робочий розчин готується в кількості, необхідній для аналізу N 1 зразків); для цього в пробірку місткістю 1,5 мл вносять з розрахунку на одну пробу по 25 мкл ПЛР-суміші 1 і по 2,0 мкл ПЛР-суміші 2; ретельно перемішують;

- в кожну пробірку  з аналізованими зразками і  в пробірки ПК і ОКИ вносять  по 27 мкл робочого розчину; 

- в кожну пробірку  додають по 1 краплі (чи 20 мкл) мінеральної  олії; - в кожну пробірку з аналізованими зразками вносять під олію по 3,0 мкл досліджуваної ДНК (використовують наконечники з аерозольним бар'єром) і закривають їх. У пробірку, маркіровану ОКИ, внести під олію 3,0 мкл негативного контрольного зразка і закрити її:

- в пробірку, маркіровану ПК, вносять під олію 3,0 мкл позитивного контрольного зразка ДНК і закривають її;

- вміст пробірок обережно  перемішують пипетированием і  центрифугируют при кімнатній  температурі впродовж 5 сек. при  10000 о./хв. (11000 g);

- усі пробірки встановлюють  у блок амплификатора і проводять ампліфікацію з урахуванням об'єму реакційної суміші, рівного 30 мкл; програма ампліфікації представлена в таблиці 2: 

 

 

 

Таблиця 2   

N п/п	Температура	Час	Кількість повторів
1	+37 °C	10 мин.	1 раз
2	+95 °C	10 мин.	1 раз
3	+94 °C +60 °C +72 °C	30 сек. 30 сек. 30 сек	30 раз
4	+72 °C	5 мин.	1 раз
5	+10 °C	Хранение

 

5.20. Результати ПЛР реєструють методом електрофорезу в 1,2% агарозном гелі, приготованому на 1-кратному трис-ацетатном (ТАЕ) буфері з використанням комплекту N 3 "Набір реагентів для виявлення селективних маркерів генетично модифікованих мікроорганізмів".

5.21. Детекция результатів ПЛР методом електрофорезу включає наступні етапи:

- приготування ТАЕ  буфера: 20 мл 50-кратного концентрованого  ТАЕ буфера вносять в мірну колбу місткістю 1000 мл, доводять до мітки дистильованою водою і ретельно перемішують;

- приготування 1,2% агарозного  гелю : 0,6 г агарози розчиняють в 50 мл 1 x ТАЕ буфера нагріванням в киплячій водяній бані до повного і рівномірного розчинення, отриманий розчин охолоджують до температури 60 °C, додають 6 мкл 1% розчину бромистого этидия і перемішують (примітка: бромистий этидий є сильним мутагеном, тому усі маніпуляції з ним і з агарозным гелем виконують в рукавичках);

- проведення електрофорезу : отриманий розчин агарозы заливають в кювету для гелю згідно інструкції до приладу для горизонтального електрофорезу;

- для створення стартових лунок в кювету поміщають гребінку із зубцями, полімеризація агарозы відбувається при температурі нижче 42 °C впродовж 10 - 20 хв.;

- після застигання  агарозы обережно виймають гребінку  і переносять гель в камеру  для проведення електрофорезу, в камеру заливають 1 x ТАЕ буфер так, щоб товщина шару рідини над гелем складала приблизно 5 мм;

- вносять в лунки агарозного  гелю по 12,5 мкл амплифицированных  зразків, підключають до камери  джерело постійного струму і  проводять електрофорез при напрузі 120 У в течію приблизно 20 хв., поміщаючи стартові лунки ближче до катода;

- виймають гель з камери, переносять  його на скло трансиллюмінатора, включають трансиллюмінатор і переглядають гель з подальшою відео- або фотодетекціею результатів. Фотовідбитки або відбитки, виконані на лазерному принтері з дозволом не менше 600 точок на дюйм, прикладають до протоколу проведення випробувань.

5.22. Інтерпретацію результатів ПЛР проводять таким чином:

- в позитивному контрольному  зразку ДНК повинна виявлятися смуга червоно-помаранчевого кольору, що відповідає за розміром специфічним фрагментам селективних маркерів ГММ;

- в негативному контрольному  зразку смуга червоно-помаранчевого  кольору має бути відсутньою;

- наявність в аналізованому  матеріалі смуги червоно-помаранчевого кольору, розташованої строго на рівні смуги позитивного контрольного зразка ДНК, свідчить про наявність в досліджуваному зразку відповідного селективного маркерного гена ГММ. За відсутності такої смуги результат вважають негативним;

- наявність смуги червоно-помаранчевого  кольору в негативному контрольному  зразку, розташованої на рівні  смуги позитивного контрольного зразка ДНК, вважають результатом контамінації.

 

VI. ПЛР З ДЕТЕКЦІЇЮ РЕЗУЛЬТАТІВ МЕТОДОМ ФЕРМЕНТНОГО АНАЛІЗУ НА БІОЛОГІЧНОМУ МІКРОЧІПІ

 

6.1. Використовуються наступні праймери:

- на 35S-промотор вірусу мозаїки  цвітної капусти :

5' CGG CTA CTC CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT TTC AGA AGA (39 н.о.) 

5' CCA TTT TCC TTT TTT ATT GTC CTT TCG ATG AAG TGA CAG A (40 н.о.);

- на маркерний ген gus з бактерії Escherichia coli:

5' ACC GTA CCT CGC ATT ACC CTT ACG CTG AAG AGA (33 н.о.) 

5' TGC CCG CTT CGA AAC CAA TGC CTA AAG AGA (30 н.о.);

- на термінатора nos з агробактерії Agrobacterium tumefaciens: 

5' GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG ACA GA (32 н.о.)  

5' GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA (35 н.о.);

- на маркерний ген  nptII з транспазона Tn5 бактеріального походження :  

5' GTG ACC CAT GGC GAT GCC TGC TTG C (25 н.о.) 

5' ACC CAG CCG GCC ACA GTC GAT GAA TCC AGA (30 н.о.) :

- на промотор ocs з агробактерії Agrobacterium tumefaciens:  

5' AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC CTA AAA GA (32 н.о.) 

5' CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA (32 н.о.).

6.2. Набір реактивів для асиметричної мультиплексною ПЛР (амПЛР) включає:

- сухі суміші, включаюча  Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфати, хлорид магнію з кінцевими  концентраціями, відповідно, 1 ед. 200 мкМ і 2,5 млМ, оптимізовану буферну систему для проведення одній стандартною ПЛР:

- розчинник;

- мінеральне масло; 

- "+" контроль ампліфікації - 1 пробірка, 0,5 мл 

6.3. Проведення реакції :

- необхідна кількість  мікропробірок з сухими реактивами промаркувати відповідним чином: "-" контроль", "досліджувані проби", " " контроль";

- додати в усі пробірки  по 5 мкл праймерів, 10 мкл розчинника;

- в пробірку, яка служить  негативним контролем, додати 5 мкл  деіонізованої води, в досвідчені пробірки - по 5 мкл розчину досліджуваної ДНК, в пробірку з позитивним контролем - 5 мкл розчину контрольної ДНК;

- додати в усі пробірки  по 20 мкл мінеральної олії; - проби  готові для проведення ампліфікації;

-запустити програму  ампліфікації :    

 

Крок програми	Температура, °C	Час інкубації, сек	Кількість циклів
1)	94	180	1
2)	94	30	42
3)	62,5	30
4)	72	180	1

 
- після проведення ампліфікації проби готові для здійснення гібридизації.  
6.4. Гібридизація ДНК, ферментний аналіз на біологічному мікрочіпі і сканування результатів :  
- набір реактивів для ДНК гібридизації і ферментного аналізу містить 20 x SSC - 50 мл, діамінобензидин (ДАБ) - 100 пігулок, конъюгат пероксидазы хріну із стрептавидином - 0,1 мл з концентрацією 1 міліграма/мл, 1 пробірка;  
- приготувати робочі розведення розчину 20 x SSC (3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрію, pH 7,4) : 2 x SSC, 0,1;

- схема приготування 100 мл розчину :

 

 

 

Розчин	20 x SSC, мл	10%-вий SDS, мл	H2O дист., мл
2 x SSC, 0,1% SDS	10,00	1	89,00
0,1 x SSC	0,50	-	99,50
0,1 x SSC, 0,1% SDS	0,50	1	98,50
0,01 x SSC	0,05	-	99,95

 

 

- мікропробірки з продуктами  ампліфікації ДНК центрифугировать 1 - 2 секунди для збору проби  на дні пробірки, додати в кожну  мікропробірку 5 мкл 20 x SSC і 0,2 мкл  10

- помістити мікрочіп у вологу камеру, поставити на 1 годину в повітряний термостат з температурою 42 °C;

- після закінчення  реакції краплі змити буфером  2 x SSC, 0,1   

6.5. Проведення ферментного аналізу :

- початковий стрептавидин-пероксидазный  конъюгат розбавити в 200 разів буфером 1 x SSC, що містить 1% БСА (бичачий сироватковий альбумін), з розрахунку 25 мкл на мікрочіп;

- нанести 25 - 30 мкл розлученого  конъюгата на робочу зону мікрочіпа  і помістити його на 30 хвилин  у вологу камеру при кімнатній  температурі; 

- змити конъюгат розчином 1 x SSC;

- залити мікрочіп розчином 2 x SSC, промити 5 хвилин;

- промити мікрочіп  розчином 1 x SSC;

- безпосередньо перед  застосуванням приготувати розчин  субстрату - діамінобензидину (ДАБ), для цього розчинити пігулку  ДАБ в 1 см3 буфера 0,1 x SSC, додати 30 мм3 3% -ного розчину пероксиду водню і перемішати, розчин використати негайно;

- залити робочу зону  мікрочіпа розчином субстрату,  витримати від 2 до 10 хвилин при  кімнатній температурі; 

- у разі позитивної  реакції з'являються коричневі плями окисленого субстрату;

- промити мікрочіп  дистильованою водою, струсити  краплі води і помістити в  термостат 42 °C на 5 - 10 хвилин, після  сушки мікрочіп із забарвленими  зонами зберігати в темному  місці. 

6.6. Сканування біологічних мікрочіпів:

- здійснювати із застосуванням  апаратно-програмного комплексу  для аналізу біологічних мікрочіпів  типу "ДЕГМІГЕН-001" і комп'ютерної програми для аналізу зображень;

- відповідно до керівництва  по експлуатації, що поставляється  в комплекті з апаратно-програмним комплексом, підготувати сканер мікрочіпів до роботи;

- помістити мікрочіп  в рамку для сканування, зафіксувати  його і закрити рамку; 

- запустити програму  сканування, що функціонує в діалоговому  режимі, дочекатися появи на моніторі  запрошення до сканування і тільки після цього вставити рамку з мікрочіпом в приймальне вікно детектора;

- після завершення  сканування мікрочіпа зберегти  зображення, присвоївши файлу відповідне  ім'я. 

6.7. Аналіз зображень біочіпів :

- запустити програму  обробки зображення мікрочіпа, ввести оцифроване зображення в програму, для цього вибрати опцію "Файл", відкрити зображення, в діалоговому вікні, що з'явилося, вибрати формат, в якому представлені зображення, і вибрати в списку потрібний файл, зображення з'явиться в основному вікні програми;