ГМО в продуктах харчування

- провести електрофорез  в режимі постійної напруги  100V 70 - 90 хвилин;

- гель (без форми) помістити  на екран трансиллюминатора; - документувати результат фореза за допомогою гель-документирующей системи, фотокопію гелю прикласти до звіту по ідентифікації.

V. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИЙ АНАЛІЗ МЕТОДОМ ПЛР З ДЕТЕКЦІЄЮ РЕЗУЛЬТАТІВ МЕТОДОМ ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ

5.1. Необхідність проведення лабораторних досліджень для конкретних видів харчової продукції, отриманої з використанням ГММ і МГМА, визначається експертом з урахуванням аналізу представленої заявником документації, переліку мікроорганізмів, що використовуваних в харчовій промисловості і мають генно-инженерно-модифицированные аналоги. Експертні дослідження включають підтвердження даних, наданих заявником, а при необхідності - перевірку на наявність можливих генетичних модифікацій, що не декларують.  
5.2. Для виявлення ГММ проводять дослідження на наявність трансгенів (сторонніх генів), регуляторних або маркерних векторних послідовностей. Наявність таких послідовностей свідчить про зроблені генетичні модифікації. Виявлення послідовностей таких генів роблять за допомогою специфічного і високочутливого методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

 5.3. Рекомендовані стратегії міжнародних організацій (ФАО/ВООЗ) для виявлення генетичних модифікацій передбачають визначення найчастіше вживаних послідовностей векторів - плазмид, за допомогою яких генетична інформація вводиться в клітину. В якості маркерів використовують гени, по яких проводять селекцію модифікованих клітин (гени антибиотикорезистентности, бактериоцинов), послідовності регуляторних векторних генів (полилинкеры, промотори або термінатори), а також послідовності мігруючих елементів. Виявлення таких послідовностей свідчить про можливі недокументовані генетичні модифікації і вимагає проведення додаткових досліджень штамів і/або продуктів.

   5.4. Проведення додаткових досліджень здійснюють з використанням методів гибридизационного і рестрикционного аналізу, секвенування, аналізу функціонування цільової вставки (вивчення РНК і білка, продукованих сторонньою ДНК) відповідно до офіційно затверджених методів аналізу.  
5.5. Для якісного визначення ДНК генно-інженерно-модифікованных мікроорганізмів в харчових продуктах і біологічно активних добавках до їжі (БАД) методом ПЦР використовують тест-системи, що включають багатокомпонентні набори реагентів і праймерів (штучно синтезованих олигонуклеотидов, комплементу відповідним ділянкам ДНК-мішені), призначені для виявлення селективних маркерних генів, найчастіше вживаних при конструюванні ГММ. Виявлення маркерних генів у штамів мікроорганізмів, використовуваних при виробництві харчових продуктів, свідчить про зроблених генетичних модифікаціях.

    У тест-системи  входять праймери, фланкирующие  наступні послідовності:  
1) гена ermC, що кодує стійкість до еритроміцину, плазмиды pE194 Staphylococcus aureus (розмір фрагмента 349 п.н.);  
2) гени tetO, що кодує стійкість до тетрацикліну хромосоми Streptococcus pneumoniae (розмір фрагмента 242 п.н.);  
3) гени amp, що кодує стійкість до ампіциліну, плазмиды pBR322 Esherichia coli (розмір фрагмента 321 п.н.);  
4) гени lacZ, що кодує фермент бета-галактозидазу, хромосоми Esherichia coli (розмір фрагмента 158 п.н.);  
5) гена ori, що кодує ориджин реплікації, плазмиды p15A Esherichia coli (розмір фрагмента 382 н.п.);  
6) гена hph, що кодує стійкість до гігроміцину, хромосоми Streptomyces hygroscopicus (розмір фрагмента 288 н.п);  
7) гена Sh ble, що кодує стійкість до блеомицину, хромосоми Streptomyces verticillus (розмір фрагмента 301н.п.).

    5.6. Вибраний відповідно до правил молекулярного дизайну і міжнародних баз даних (із застосуванням програм "Oligo 4.0", "Blast" і їх аналогів) набір праймерів забезпечує проведення багатофакторного аналізу вибраних послідовностей.  
5.7. Для кожної конкретної пари праймерів ПЛР проводять з використанням оптимального співвідношення компонентів реакційної суміші, структури програми ампліфікації (тимчасових і температурних характеристик кожного етапу ампліфікації) і адекватного методу детекции результатів, для виключення перехресних реакцій з неспецифічною ДНК і забезпечення необхідного рівня чутливості і специфічності реакції.

5.8. Специфічність і чутливість наборів праймерів і реагентів (позитивні результати ПЛР в пробах з контролями ДНК селективних маркерів при концентрації не менше 5 x 10(4) ГЭ/мл, відсутність перехресних реакцій з неспецифічною ДНК при концентрації не менше 1 x 10(3) ГЕ/мл) підтверджують на препаратах ДНК, виділених з штамів мікроорганізмів, вказаних в таблиці 1.

Таблиця 1

5.9. Для виявлення ДНК генно-інженерно-модифікованих мікроорганізмів в пробах з різними рівнями змісту мікробної ДНК і ДНК харчового субстрату використовують два види тест-систем :  
- комплект N 1А для виділення ДНК з ферментних препаратів, культур стартерів і заквашувальних, БАД;  
- комплект N 1Б для виділення ДНК з харчових продуктів.  
5.10. Виділення ДНК з бактерійних культур за допомогою комплекту N 1А включає лізис бактерійних клітин з подальшим осадженням ДНК на двоокисі кремнію. Виділення ДНК із зразків харчових продуктів за допомогою комплекту N 1Б включає попередню обробку проби гомогенізованих зразків протеиназой До, лізис, додаткову обробку депротеинизирующим розчином і осадження ДНК на двоокисі кремнію.

 5.11. Для виявлення ГММ і МГМА в харчових продуктах використовують наступні матеріали, устаткування, реактиви:  
1) програмований термостат (ДНК-амплификатор) типу "Терцик МС2" або інші типи амплификаторов, зареєстровані в Російській Федерації в установленому порядку;  
2) термостат, що підтримує температуру 45 °C, для пробірок об'ємом 1,5 мл;  
3) центрифуга із швидкістю обертання ротора до 12 000 о./хв. для пробірок місткістю 1,5 і 0,5 мл типу "эппендорф";  
4) підтрушувач вібраційний типу "вортекс" із швидкістю обертання до 3 000 о./хв.;  
5) прилад для горизонтального електрофорезу;  
6) джерело постійного струму;  
7) водяна лазня з підігріванням до 95 °C або СВЧ-печь;  
8) ультрафіолетовий трансиллюминатор;  
9) очок/маска захисні;  
10) холодильник побутовий електричний;

11) морозильна камера, що забезпечує температуру (- 20) °C або нижче;  
12) гомогенізатор типу "SilentCrusher" або інших моделей;  
13) ступка фарфорова з товкачиком;  
14) пінцет медичний;  
15) ножиць медичних;  
16) скальпель медичний;  
17) вагів лабораторні загального призначення 2-го класу точності;  
18) дистилятор;  
19) аналізатор потенціометр;  
20) опромінювач бактерицидний настінний;  
21) дозатори зі змінним об'ємом дозування : 0,2 - 2,0 мм3 з кроком 0,01 мм3, 0,5 - 10,0 мм3 з кроком 0,01 мм3, 2 - 20 мм3 з кроком 0,01 мм3, 20 - 200 мм3 з кроком 0,1 мм3, 100 - 1000 мм3 з кроком 1 мм3, 2 - 10 см3 з кроком 0,1 см3;  
22) пробірки типу "эппендорф" місткістю 1,5 мл;  
23) пробірки типу "эппендорф" для ПЦР місткістю 0,5 мл;  
24) наконечники полімерні об'ємом 1 - 200 мкл;  
25) наконечників полімерні об'ємом 200 – 1000 мкл;

26) рукавичок гумових;  
27) колб плоскодонні конічні різній місткості;  
28) циліндрів скляні мірні лабораторні місткістю 25, 100, 1000 см3;  
29) воронок скляних;  
30) штативів для пробірок об'ємом 1,5 і 0,5 мл;  
31) комплект N 1А для виділення ДНК з ферментних препаратів, культур стартерів і заквашувальних, БАД до їжі;  
32) комплект N 1Б для виділення ДНК з харчових продуктів;  
33) комплект N 2 "Набір реагентів для виявлення селективних маркерів генетично модифікованих мікроорганізмів";  
34) комплект N 3 "Набір реагентів для виявлення селективних маркерів генетично модифікованих мікроорганізмів";  
35) реактивів:  
- тритон X - 100,  
- гуанідину гидрохлорид,  
- ЕДТА (етилендиамінтетраоцетова кислота),  
- додецилсульфат натрію,  
- суспензія двоокису кремнію,  
- фенол водонасичений,  
- хлороформ водонасичений,  
- спирт етиловий ректифікований,  
- ацетат амонія,  
- протеиназа До,

- магнію хлорид,  
- калію хлорид,  
- водний розчин дезоксинуклетидтрифосфатів (0,1 М),  
- креозоловий червоний,  
- термостабільна ДНК-полімераза,  
- олія вазелінова,  
- трис-ацетат,  
- крижана оцтова кислота,  
- агароза для електрофорезу,  
- бромистий етидій,  
- вода деіонізована.  
5.12. Допускаються до використання тест-системи, комплекти (набори) реагентів і матеріали аналогічного призначення інших типів, дозволені до застосування в установленому порядку і з характеристиками, що забезпечують проведення досліджень відповідно до справжніх Методичних вказівкок.

5.13. Відібрані згідно зі встановленим порядком і нормами відбору проб (відповідно до офіційно ухвалених нормативних і технічних документів) зразки готують до процедури виділення ДНК ГММ і МГМА двома способами, залежно від їх приналежності до груп харчової продукції :  
- із зразків проб ферментних препаратів, заквашувальних і стартерів культур, БАД готують розчини 30% -ої концентрації в стерильній деіонізованій воді. Для цього вносять 300 міліграм (мкл) порошку або суспензії початкового зразка в 700 мкл стерильної деіонізованої води і перемішують на вихровому змішувачі впродовж 3 - 5 с. При необхідності зразок заздалегідь змізерніють до гомогенного стану в ступці або з допомогою гомогенізатора;

- із зразків інших  харчових продуктів готують розчини  50% -ої концентрації, для чого до 500 міліграма (мкл) проби додають  500 мкл стерильної деіонізованої води і перемішують на вихровому змішувачі впродовж 3 - 5 с. Твердий зразок заздалегідь змізерніють до гомогенного стану в ступці або за допомогою гомогенізатора.  
Підготовлені зразки використовують для аналізу того ж дня. Допускається зберігання зразків при температурі мінус 20 °C не більше 2-х тижнів.  
5.14. Виділення ДНК ГММ і МГМА із зразків досліджуваної харчової продукції проводять з використанням комплектів (наборовши) реагентів для виявлення селективних маркерів генно-инженерно-модифицированных мікроорганізмів. Допускається застосування фенол-хлороформного або іншого адекватного методу екстракції ДНК.  
5.15. Виділення ДНК із заквашувальних і стартерів культур, БАД до їжі, ферментних препаратів проводять з використанням комплекту N 1А "Набір реагентів для виявлення селективних маркерів генетично модифікованихмодифікованих мікроорганізмів".  
Комплект N 1А для виділення ДНК включає:  
- розчин, що лізирує, гуанидинтиоцианат (розчин 1), що містить, - 1 фл. (30 мл);  
- розчин для відмивання, гуанидинтиоцианат (розчин 2), що містить, - 1 фл. (15 мл);  
- розчин для відмивання (розчин 3) - 2 фл. (по 70 мл);  
- суспензія двоокису кремнію - 1 пробірки (0,5 мл).

 5.16. Виділення ДНК комплектом N 1А включає наступні етапи:  
- досліджуваний матеріал в об'ємі 700 мкл центрифугируют впродовж 10 хвилин при кімнатній температурі ( 18 - 25 °C) при 12000 о./хв.;  
- видаляють 600 мкл надосадочної рідини; матеріал (100 - 110 мкл), що залишився, ретельно перемішують в пробірці на вортексі і додають до суспензії 300 мкл розчину 1 і 5 мкл суспензії двоокису кремнію;  
- проби інкубують впродовж 15 хвилин при кімнатній температурі, періодично перемішуючи на вортексі;  
- проби центрифугують впродовж 30 сек., при кімнатній температурі при 12000 о./хв., супернатант видаляють;  
- до осаду додають 150 мкл розчину 2, струшують його на вортексе і центрифугируют впродовж 30 сек. при кімнатній температурі при 12000 о./хв., супернатант видаляють;  
- до осаду додають 700 мкл розчину 3, струшують його на вортексе і центрифугируют впродовж 30 сек. при кімнатній температурі при 12000 о./хв., супернатант видаляють; проводять повторну процедуру відмивання;

- додатковим центрифугуванням  з подальшим видаленням супернатанту  прибирають залишки розчину 3, проби підсушують впродовж 5 хв. при  температурі 45 °C, залишаючи пробірки відкритими;  
- додають в кожну пробірку 50 мкл деіонізованої води, перемішують на вортексе і інкубують впродовж 5 хв. при температурі 45 °C;  
- проби центрифугируют при кімнатній температурі впродовж 30 сек. при 12000 о./хв., водну фазу відбирають в іншу пробірку і використовують як досліджуваний зразок ДНК для постановки реакції ампліфікації або зберігають при температурі - 20 °C не більше двох тижнів.

5.17. Виділення ДНК ГММ і МГМА з харчових продуктів проводять з використанням комплекту N 1Б "Набір реагентів для виявлення селективних маркерів генетично модифікованих мікроорганізмів". При підвищеному вмісті жирів проводиться додаткова екстракція суспензією неполярних розчинників з водою для перекладу ДНК, що міститься в харчовому продукті, у водну фазу, в якій і робиться подальше очищення.

Комплект N 1Б для виділення ДНК  з харчових продуктів включає:

- розчин 1 (буфер, що лізирує, pH 8,0) - 1 фл. (15 мл);

- розчин 2 (суміш фенолу з хлороформом, 1:1) - 1 фл. (20 мл);

- розчин 2 (суміш фенолу з хлороформом, 1:1) - 1 фл. (20 мл);

- розчин 3 (хлороформ) - 1 фл. (20 мл);

- розчин 4 (ацетат амонія 5 М) - 1 фл. (5,0 мл);

- розчин 5 (спирт етиловий 96%) - 4 фл. (по 20 мл);

- розчин 6 (спирт етиловий 75%) - 1 фл. (12 мл);

- розчин 7 (ТЕ-буфер, pH 8,0) - 1 фл. (6,0 мл);

- протеиназу До - 1 пробірки (3,0 міліграми).

3.18. Виділення ДНК комплектом N 1Б включає наступні етапи:

- розчин 1 прогрівають при температурі  25 °C до повного розчинення  осаду, безпосередньо перед застосуванням  до розчину 1 додають протеиназу До до концентрації 200 мкг/мл (0,001 г на 5,0 мл);