ГМО в продуктах харчування

I. АПАРАТУРА,  ІНСТРУМЕНТИ, ЛАБОРАТОРНИЙ ПОСУД,  РЕАКТИВИ

 

 1.1. Для проведення ідентифікації і кількісного визначення ГМО рослинного походження використовується наступна апаратура і інструменти :

- ампліфикатори типу ABI Prism 7000, iCycler iQ, Rotor Gene - 3000 (6000), AHK - 32, "Терцик МС-2" і інші;

- комплекс апаратно-програмний  для аналізу біологічних мікрочіпів  типу "ДЕРМІГЕН-001"; - прилад для горизонтального електрофорезу типу "Mini - Sub Cell GT System" з комплектом кювет і гребінок;

- джерело напруги типу "Power Pac 300" з діапазоном регульованої напруги 50 - 300 В;

- трансиллюминатор типу  Т12 із захисним екраном, діапазон  випромінювання 300 - 400 нм;

- відеосистема типу "Gel Doc 2000(ТМ) ", призначена для введення в комп'ютер, аналізу і документування зображень люминесцирующих слідів ДНК в гелях, забарвлених бромистим этидием, чутливість - не менше 10 нг ДНК (по бромистому этидию);

- холодильник побутовий  електричний типу "Електролюкс", з температурою морозильної камери  мінус 20 °C;

- мікроцентрифуга настільна типу Еппендорф (частота обертання не менше 13000 хв.(- 1));

- термостат типу "TERMO 24-15" під пробірки типу Епендорф місткістю 0,5 і 1,5 мл, діапазон температур від 15 °C до 120 °C, кількість гнізд - не менше 20 кожного типу, точність підтримки температури - 0,2 °C, різниця температур між сусідніми осередками - не більше 0,5 °C;

- термостат сухоповітряний  типу ТВЗ-25 з робочою температурою 42 °C, робочий діапазон від 20 °C  до 60 °C, точність підтримки температури  /- 1 °C;

- апарат для струшування типу "Вортекс", швидкість обертання 250 - 3000 хв.(- 1);

- пекти мікрохвильова  (потужністю не менше 400 W); - ваги  лабораторні загального призначення  2-го класу точності з найбільшою  межею зважування 200 г; 

- аналізатор потенціометр  типу МР 220, погрішність вимірів pH /- 0,01;

- гомогенізатор перистальтичного типу "Стомайкер" або інших моделей;

- опромінювач бактерицидний  настінний типу ОБН-150; - дозатори  зі змінним об'ємом дозування  : 0,2 - 2,0 мкл з кроком 0,01 мкл, з  точністю /- 1,2%; 0,5 - 10,0 мкл з кроком 0,01 мкл, з точністю /- 0,8%; 2 - 20 мкл з кроком 0,01 мкл, з точністю /- 0,8%; 20 - 200 мкл з кроком 0,1 мкл, з точністю /0,6%; 100 - 1000 мкл з кроком 1 мкл, з точністю /- 3%; 2 - 10 мл з кроком 0,1 мл, з точністю /- 0,5%.

1.2. Для проведення ідентифікації і кількісного визначення ГМО рослинного походження використовується наступний лабораторний посуд:

- циліндри мірні лабораторні  місткістю 10, 25, 100, 1000 мл, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Z 327263-2 EA, Z 327301-2 ЕА, Z 327379-2 ЕА, Z 327476-2 ЕА;

- колби мірні лабораторні  місткістю 25, 50, 100, 250, 1000 мл, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Z 329517-1 EA, Z 329525-1 EA, Z 329533-1 ЕА, Z 329541-1 EA, Z 329576-1 EA;

- пробірки микроцентрифужные  типу Эппендорф місткістю 0,2, 0,5, 1,5 мл;

- наконечники з фільтром  для дозаторів зі змінним об'ємом  дозування до: 10; 20; 200; 1000 мкл; 10 мл.

1.3. Для проведення ідентифікації і кількісного визначення ГМО рослинного походження використовуються наступні реактиви:

- кислота соляна, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Н 1758;

- кислота борна, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N В 7901;

- натрій їдкий, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N 221465;

- натрій хлористий,  корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N S 3014;

- етилендиамінтетраоцетова  кислота (ЕДТА), корпорація "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N Е 5134;

- гексадецилтриметиламмониум  бромід (СТАВ), корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Н 5882;

- трис (оксиметил) амінометан, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Т 6791;

- альбумін бичачий сироватковий  сухий (БСА), корпорація "Сигма  Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287;

- этидий бромистий, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Е 4391;

- спирт етиловий, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат N 459836;

- спирт изопропиловый,  корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N 19516;

- хлороформ, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N 151823; - вода деіонізована, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N W 4502;

- вода дистильована, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N W 3500;

- 2-меркаптоетанол, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N М 3148;

- термостабільний фермент  Taq -полимераза, оптимум роботи в  області 70 °C - 72 °C, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 1806;

- буфер для ПЦР з MgCl2, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Р 2192;

- агароза для електрофорезу  (тип П), корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N А 6877; - маркер молекулярної маси ДНК, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Р 1473;

- стандартний зразок  складу генетично немодифікованого організму рослинного походження, корпорація "Сігма Алдрич" (Fluka), кат. N 53198;

- стандартний зразок  складу ГМО рослинного походження, корпорація "Сігма Алдрич" (Fluka), кат. N 44386;

- 2 '- дезоксиаденозин-5 'трифосфорной  кислоти тетранатрієвая сіль, тригідрат (АТФ), корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 4788;

- 2 '- дезоксицитидін-5 'трифосфорной кислоти тетранатриевая сіль, тригідрат (ЦТФ), корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 4913;

- 2 '- дезоксигуанозин-5 'трифосфорной кислоти тетранатриевая сіль, тригідрат (ГТФ), корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Д 5038;

- 2 '- дезокситимідин-5 'трифосфорної кислоти тетранатриевая сіль, тригідрат (ТТФ), корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N Т 9656;

- праймери, ЗАТ "Синтол" (Росія); - натрію додецилсульфат (SDS), корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N L 4390;

- 3% -вий розчин перекису водню, корпорація "Сігма Алдрич" (Sigma), кат. N 7722.

1.4. Допускається використання іншої апаратури, інструментів і реактивів з технічними характеристиками не гірше вказаних вище за вітчизняне і зарубіжне виробництво, дозволених для застосування в установленому порядку.

 

II. ПІДГОТОВКА  ДО АНАЛІЗУ

 

2.1. Приготування розчинів :

- для приготування 1М  ТРИС - HCl (pH 7,5) в мірній колбі на 100 мл розчинити 12,11 г Трис (оксиметил) амінометану в 80 мл дистильованої води, довести pH концентрованою соляною кислотою до 7,5, довести об'єм розчину до мітки деионизованной водою, перемішати, зберігати при температурі - 20 °C в течію не більше року;

- для приготування 5М  NaCl розчинити 29,22 г натрію хлористого  в 100 мл дистильованої води, перемішати, зберігати в колбі з притертой  пробкою при кімнатній температурі  до 1 року; - для приготування 30% -ной  NaOH розчинити 3 г натрію гідроокису в 7 мл дистильованої води;

- для приготування 0,5М ЕДТА (pH 8,0) в мірній колбі на 100 мл розчинити 18,62 г етилендиамінтетраоцетової кислоти в 80 мл дистильованої води, розчином 30% -ной натрію гідроокису довести pH розчину до 8,0, дистильованою водою об'єм розчину довести до мітки, перемішати, зберігати в колбі з притертой пробкою при кімнатній температурі до 1 року.

2.2. Приготування хлороформу, насиченого водою :

- змішати 100 мл хлороформу з  20 мл деіонізованої води і залишити  на 24 ч для насичення;

- термін зберігання при температурі  від 4 °C до 5 °C - не більше 6 міс. 

2.3. Приготування 70% -го розчину етилового спирту :

- змішати 70 мл 96% -го етилового  спирту з 26 мл деіонізованої  води;

- термін зберігання при температурі  від 4 °C до 5 °C - не більше 2 міс.

2.4. Приготування розчину БСА (20 мкг/мл) :

- розчинити 0,002 г сухого альбуміну  бичачого сироваткового в 1 мл  деіонізованої води, 10 мкл отриманого  розчину змішати з 990 мкл деіонізованої  води;

- термін зберігання в морозильній  камері при температурі мінус 20 °C - не більше 6 міс.

2.5. Приготування буфера (2% -го "СТАВ"), що лізирує :

- розчинити 0,5 г гексадецилтриметиламмония  броміду в 10 мл деіонізованої  води, додати 2,5 мл 1M Трис - HCl, 7 мл 5М NaCl, 1 мл 0,5М ЭДТА, довести об'єм розчину деіонізованою водою до 25 мл, перемішати;

- термін зберігання при температурі  від 4 °C до 5 °C - не більше 6 міс. 

2.6. Приготування 1 x ТВЕ буфера для електрофорезу:

- в мірній колбі на 1000 мл розчинити  10,8 г Трис (оксиметил) амінометану, 5,5 г борної кислоти і 0,92 г етилендиамінтетраоцетової кислоти, довести дистильованою водою до мітки, перемішати до повного розчинення;

- термін зберігання 1х розчину  - 10 днів.

2.7. Приготування розчину бромистого этидия - C21H20N3Br (10 міліграм/мл) :

- розчинити 1 г бромистого этидия в 100 мл дистильованої води;

- термін зберігання в посуді  темного скла при температурі  від 4 °C до 5 °C - 12 міс. 

2.8. Приготування осаджуючого буфера СТАВ:

- в мірну колбу внести 1 г СТАВ, 0,5 г NaCl, додати 100 мл деіонізованої води, довести розчином 30% -го натрію гідроокису pH розчину до 8,0, довести об'єм деіонізованою водою до 200 мл; - зберігати при 4 °C не більше 6 місяців.

2.9. Приготування 1,2М NaCl :

- розчинити 7,0 г NaCl в 100 мл деіонізованої води, перемішати;

- зберігати в колбі  з притертой пробкою при кімнатній  температурі до 1 року.

2.10. Приготування 10% -го розчину SDS :

- розчинити 10 г SDS в 90 мл дистильованої води;

- зберігати при кімнатній  температурі не більше 1 року.

 

IІІ. ВИДІЛЕННЯ ДНК

 

3.1. Метод виділення ДНК з допомогою СТАВ:

- навішування досліджуваного гомогенізованого  продукту масою 100 міліграм помістити  в микроцентрифужную пробірку  типу Эппендорф на 1,5 мл;

- додати 300 мкл деіонізованої води, перемішати шпателем;

- додати 500 мкл СТАВ-буфера, що лізирує, з меркаптоэтанолом, ретельно перемішати шпателем;

- інкубувати при 65 °C 90 хвилин;

- центрифугировати 10 хвилин при 13000 о./хв.;

- перенести 500 мкл супернатанту  в чисту пробірку типу Эппендорф  місткістю 1,5 мл;

- додати 500 мкл хлороформу, перемішати на вортекс 30 секунд;

- центрифугировать 10 хвилин при  13000 о./хв.;

- перенести 500 мкл верхньої фракції  в чисту пробірку, додати 500 мкл  хлороформу, перемішати;

- центрифугировать 5 хвилин при  13000 о./хв.;

- перенести верхню фракцію в чисту пробірку типу Эппендорф місткістю 1,5 мл, не захоплюючи шар хлороформу;

- додати 2 об'єми СТАВ-осаждающего  буфера, перемішати пипетированием;

- інкубувати 60 хвилин при кімнатній  температурі; 

- центрифугировати 5 хвилин при 13000 о./хв.;

- видалити супернатант; 

- розчинити осад в 350 мкл NaCl (1,2М);

- додати 350 мкл хлороформу, перемішати  на вортекс 30 секунд;

- центрифугировать 10 хвилин  при 13000 о./хв.; - перенести верхню  фракцію в чисту пробірку типу  Эппендорф місткістю 1,5 мл;

- додати 0,6 об'єму изопропилового  спирту, перемішати;

- центрифугировати 10 хвилин при 13000 о./хв.;

- видалити супернатант;

- додати 500 мкл 70% -го  розчину етилового спирту і  перемішати на вортекс; 

- центрифугировать 10 хвилин  при 13000 о./хв.;

- видалити супернатант;

- підсушити осад не  більше 5 хвилин при 65 °C для  видалення крапель спирту;

- розчинити осад в  100 мкл деіонізованої води, обережно  струшуючи, отриманий розчин ДНК  готовий для проведення полімеразної  ланцюгової реакції (ПЛР);

- зберігати при мінус 20 °C. 4.2. Сорбційний метод виділення ДНК :

- в центрифужні пробірки типу Эппендорф на 1,5 мл внести 300 міліграм бісеру і 70 - 80 міліграм аналізованого матеріалу, додати 0,5 мл 5 мМ Na2 -соль ЕДТА і термостатувать 30 - 60 хвилин при 65 °C;

- до вмісту пробірки  додати 400 мкл реагенту, що лізирує,  перемішати на вортекс до максимально  однорідного стану, термостатувать при 65 °C 60 - 120 хвилин;

- перемішати на вортекс,  додати 500 мкл бідистильованої води, перемішати на вортекс; 

- центрифугировати 1 хвилину при 12000 о./хв., прозорий супернатант перенести в чисту пробірку;

- додати 20 мкл сорбенту, пробірку помістити на ротатора або перемішувати на вортекс 10 хвилин при 10 - 20 о./хв.;

- центрифугировать 10 секунд  при 12000 о./хв.;

- видалити супернатант, до осаду додати 200 мкл реагенту, що лізирує, перемішати на вортекс до однорідного стану, центрифугировать 10 секунд при 12000 о./хв.;

- видалити супернатант,  до осаду додати 1 мл робочого  розчину сольового буфера, перемішати  вміст пробірки перевертанням 5 - 10 разів, центрифугировать 10 секунд при 12000 о./хв.;

- видалити супернатант,  не зачіпаючи осаду; 

- до осаду додати 1 мл робочого розчину сольового  буфера, перемішати на вортекс,  центрифугировать 10 секунд при 12000 о./хв., видалити супернатант;

- повторити попередній  пункт ще раз; 

- підсушити осад при  65 °C впродовж 4 - 5 хвилин: - до осаду  додати 50 мкл екстракційного розчину,  відбір розчину з початкового  флакона проводити при постійному  помішуванні, не допускаючи випадання в осад гранул іонообмінної смоли;

- суспендувати вміст  пробірки на вортекс 5 - 10 секунд  до гомогенного стану, потім  термостатировать 10 хвилин при 65 °C;

- повторно суспендувати  пробу на вортекс, центрифугировать 1 хвилину при 12000 о./хв.;

- розчин ДНК перенести в чисту пробірку, зберігати при мінус 20 °C.

 

ІV. ПРОВЕДЕННЯ ЕЛЕКТРОФОРЕЗУ В АГАРОЗНОМ ГЕЛІ

 

4.1. Приготування 2% -ного агарозного гелю :

- до 1 г агарозы додати 50 мл 1х буфера ТВЕ, ретельно  перемішати;

- отриманий розчин  помістити в мікрохвильову піч на 2 - 5 мін або прокип'ятити на водяній лазні 15 мін до повного розплавлення агарозы;

- розплавлену агарозу  охолодити до 56 °C, додати 5 мкл бромистого  этидия, ретельно перемішати, розлити  в підготовлену форму, товщина  гелю 0,5 - 0,7 см, через 30 - 40 хвилин видалити гребінку;

- готовий гель використати  відразу або зберігати в 1х  ТВЕ буфері в холодильнику  при 4 °C.

4.2. Проведення електрофорезу :

- 10 мкл реакційної  суміші після аплификации внести  в лунку гелю, в одну з лунок  внести маркер молекулярної маси :

-помістити заповнений гель в камеру для електрофорезу з буфером 1х ТБЕ, товщина шару буфера над поверхнею гелю ~ 2 - 3 мм;