Методы биохимического исследования заболеваний печени

Период

выполнения

Краткое содержание выполняемых работ

Отметка руководителя о выполнении

Организация практики

Инструктаж по технике безопасности

Обзор литературы по теме исследования

Изучение методов исследования заболеваний поджелудочной железы

Обработка и анализ полученных данных

Подготовка отчета по практике, оформление

Защита отчета по практике

Место прохождения практики МБУЗ «Городская поликлиника №3», КДЛ

Знакомство с лабораторией.

Клинико-диагностическая лаборатория находится на 4 этаже здания, занимает отдельное крыло, отгорожено дверью. Помещение лаборатории состоит из пяти кабинетов.Централизованное горячее и холодное водоснабжение, отопление и канализация. Вентиляция: приточно-вытяжная. В подвальном помещении расположена кладовая лаборатории.

Штат лаборатории: зав. отделением, один врач-лаборант,три биолога, три фельдшера- лаборанта, два лаборанта, две санитарки.

Работа клинико-диагностической лаборатории осуществляется на основании приказа МЗРФ №380 от 25.12.1997 г. «О состоянии и мерах по совершенствованию лабораторного обеспечения диагностики и лечения пациентов в учреждениях Здравоохранения Российской Федерации».

В лаборатории проводится 30 общеклинических исследований; включая исследования крови, мочи, экссудатов и транссудатов, кала, отделяемого мочеполовых органов; 19 гематологических исследований; 6 показателей гемостаза (ПТИ, МНО выполняется с января 2010 г.) 30 биохимических показателей (капиллярная глюкоза крови, ГГТФ, ЛДГ, ЩФ, сывороточное железо, кальций общий, ЛПВП, ЛПНП -выполняется с января 2010 г.); 16 иммунологических исследований – в том числе методики проведения исследований онкомаркеров РSA, СА-125, РЭА, АФП, СА-19) – 9 были освоены и внедрены в работу лаборатории с декабря 2009 г – в рамках национального проекта «Здоровье». C января 2010 г. лаборатория выполняет гормональные исследования, определяющие функциональное состояние щитовидной железы – определяется концентрация тиреотропного гормона, свободного тироксина, уровень антител к тиреопероксидазе.

Приказы и нормативные документы

1. Приказ №720 МЗ СССР  от 31.07.78г. «Об улучшении медицинской  помощи больным с гнойными  хирургическими заболеваниями и  усилении мероприятий по борьбе  с внутрибольничной инфекцией».

2. Приказ №475 МЗ СССР  от 16.08.89г.«О мерах по дальнейшему совершенствованию профилактики заболеваемости острыми кишечными инфекциями в стране ».

3. Приказ №342 МЗ РФ от 26.11.98г.«Об усилении мероприятий по профилактике эпидемического сыпного тифа и борьбе с педикулезом».

4. ФЗ РФ №77 от 18.06.01г.«О предупреждении распространения туберкулеза в РФ».

5. Приказ №408 МЗ СССР  от 12.07.89г. «О мерах по снижению  заболеваемости вирусными гепатитами  в стране».

6. ОСТ 42-21-2-85 «Стерилизация  и дезинфекция изделий медицинского  назначения. Методы, средства и режимы».

7. Приказ №245 МЗ СССР  от 30.08.91г. «О нормативах потребления  этилового спирта для учреждений  здравоохранения, образования и  социального обеспечения».

8. Приказ №170 МЗ РФ от 16.08.94г.«О мерах по совершенствованию профилактики и лечения ВИЧ-инфекции в РФ».

9. Сан Пин 2.1.3.2630-10«Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность»

10. Сан Пин 2.1.7. 2790-10«Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».

Журналы которыми пользуются в лаборатории

1. Журнал регистрации « 3»
2. Журнал регистрации общего анализа крови
3. Журнал регистрации «время свертываемости крови»
4. Журнал регистрации «время кровотечения»
5. Журнал регистрации тромбоцитов
6. Журнал регистрации гемоглобина
7. Журнал регистрации исследование уровня лейкоцитов в крови
8. Журнал регистрации СОЭ и лейкоциты
9. Журнал регистрации СОЭ
10. Журнал регистрации биохимических исследований
11. Журнал регистрации «МНО»
12. Журнал регистрации «ПТИ»
13. Журнал регистрации «RW»
14. Журнал регистрации «гормоны»
15. Журнал регистрации «онкомаркеры»
16. Журнал регистрации «общий анализ мочи»
17. Журнал регистрации «Анализ мочи по Нечипоренко»
18. Журнал регистрации «проба Зимницкого»
19. Журнал регистрации «обнаружение глюкозы и кетоновых тел в моче»
20. Журнал регистрации «определение желчных пигментов в моче»
21. Журнал регистрации «GN»
22. Журнал регистрации «секрет простаты»
23. Журнал регистрации «капрограмма»
24. Журнал регистрации «кал на я/глист»
25. Журнал регистрации «анализ кала на скрытую кровь»
26. Журнал регистрации «общий анализ мокроты»
27. Журнал регистрации «анализ мокроты на КУБ»
28. Журнал регистрации «DS малярии»

Обработка лабораторной посуды. Из пробирок удаляются отходы крови. Отходы крови помещаются в специально выделенную емкость. Пробирки помещаются для накопления в емкость с 0,05% нейтральным анолитом. После накопления пробирки в перчатках с соблюдением мер предостороженности перекладываются в емкость с 0,05% раствором нейтрального анолита на 60 мин для дезинфекции. Предстерилизационная очистка пробирок производится в этой же емкости после окончания дезинфекционной экспозиции с помощью ершей и ватно-марлевых тампонов. Пробирки прополаскиваются под проточной водой не менее 5 мин. Пробирки прополаскиваются в дистиллированной водой. Пробирки просушиваются до исчезновения влаги. Стерилизация пробирок осуществляется в суховоздушном стерилизаторе при температуре 1800С 60 мин в открытом виде без дополнительной упаковки. Стерилизация партии пробирок регистрируется в журнале.

Обработка центрифуги. Ротор стенки и крыщка центрифуги протираются веташью, смоченной в 0,05% нейтральном анолитом, двукратно с интервалом 15 мин. Стаканчики обеззараживаются погружением в 0,05% нейтральным анолитом. По окончанию дезинфекционной экспозиции стаканчики промываются в нейтральном анолите для удаления возможных остатков крови и прополаскиваются под проточной водой. Использованная ветошь обеззараживается.

Обработка отходов биологической жидкости (кровь, сыворотка). Собирается в емкость, которую добавляются таблетки препарата «Жавель Солид» из расчета две таблетки. После окончанию экспозиции отходы выливаются в канализацию. Использовать для слива раковины, предназначенные для мытья рук персонала, а также для обработки лабораторной посуды, инвентаря запрещается.

Обработка перчаток. После использования перчатки собираются в емкость с 0,05% нейтральным анолитом, полученным на установке СТЭЛ на 60 мин. После окончанию дезинфекционной экспозиции перчатки упаковываются в полиэтиленовый пакет. Пакет закрывается или завязывается и утилизируется.

Прием и маркировка и исследуемого материала для биохимических исследований. Доставленный в лабораторию биоматериал в пробирке, маркируют так, чтобы номер пробирки соответствовала номеру бланка.

Работа с документацией в лаборатории. Все результаты исследований фиксируются в журнале. Указывают номер бланка, Ф.И.О. пациента, номер амбулаторной карты.В случае потери бланка анализа, результаты можно найти в журнале.

Получение плазмы крови. Кровь в присутствии гепарина центрифугируют получают плазму лишенная фибриногена. Осадок не сворачивается за счет гепарина.

Получение сыворотки крови. Кровь центрифугируют при 1000 об/мин в течение 10 мин., получают сыворотку крови без форменных элементов

Определение билирубина крови. Реакция Ван Ден Берга.

Реактивы:

 1. Спирт ректификат 96°.

2. Диазореактив Эрлиха, состоящий из следующих двух растворов, которые смешивают к моменту постановки реакции. Раствор I: сульфаниловой кислоты — C6H4(NH2)S03H 2H20 — 1 г, соляной кислоты (удельного веса 1,12) — 15 мл, дистиллированной воды — 1 л. Сульфаниловую кислоту смешивают в литровой колбе с соляной кислотой и небольшим количеством дистиллированной воды, а затем нагревают до растворения, после чего прибавляют остальную воду. Раствор II: 0,5% азотнокислого натрия (NaN02). Диазореактив Эрлиха состоит из 8 мл раствора 1 и 0,25 мл раствора II. Раствор II не должен содержать избытка азотистой кислоты (отсутствие посинения йодо-калиево-крахмальной бумажки).

3. Стандартный раствор 2,161 г сернокислого  кобальта (CoS04) растворяют в 100 мл  воды. Ввиду того, что продажный  препарат содержит много воды, его высушивают методом Пинкуссена (Pincussen).

Препарат высушивают нагреванием до слабо-красного каления и по охлаждении приготовляют 2% раствор, по окраске соответствующий раствору билирубина 1:200 000 (0,5 мг%). Раствор устойчив.

Оборудование. Две пипетки Мора в 1 мл для крови и в 2 мл для спирта. Градуированные пипетки: одна в 1 мл и две по 2 мл Пробирки центрифужные. Колориметр.

 Постановка реакции. Для реакции  необходимо 1—2 мл сыворотки, для  чего надо взять 4—5 мл крови.

Кровь, взятую из вены, для свертывания ставят на 3—4 часа Полученную прозрачную сыворотку в количестве 1 мл сливают в центрифужную пробирку, прибавляют 2 мл спирта, жидкости хорошо смешивают и центрифугируют.

1 мл отцентрифугированной прозрачной жидкости вливают в сосуд колориметра, прибавляют 0,25 мл реактива 2 (диазореактив) и 0,5 мл спирта. Получается смесь от розоватого до красного цвета. В пустой клин или стаканчик колориметра наливают стандартный раствор (3) и через 10 минут колориметрируют.

 При образовании сине-фиолетового  оттенка (от избытка кислотности  смеси) к смеси прибавляют одну  каплю спиртового раствора аммиака, при этом получается красный  цвет. От избытка щелочи получается  желтоватый оттенок, в таких случаях  к смеси прибавляют одну каплю  соляной кислоты в разведении 1 : 20.

Определение билирубина в крови - унифицированный метод по диазореакции в присутствии акселератора (метод Ендрассика-Клеггорна-Грофа).

Необходимые реактивы для определения билирубина

1.  Кофеин.

2.  Натрия бензонат.

3.  Натрия ацетат 3-водный.

4.  Кофеиновый реактив: 5 грамм кофеина, 7,5 грамм бензоната натрия, 12,5 грамма ацетата натрия растворяют в 90 миллилитров воды, нагревают до температуры 50—60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доливают водой до 100 миллилитров. Раствор стабилен в течение 2 недель.

5.  Натрия хлорид, 154 ммоль/литр (изотонический раствор): 0,9 грамма хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 миллилитров и доливают до метки водой.

6.  НСl концентрированная.

7.  Сульфаниловая кислота.

8.  Диазосмесь. Диазореактив I:5 грамм сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300—400 миллилитрах воды, прибавляют 15 миллилитров концентрированной НС1. Если сульфаниловая кислота полностью не растворяется, колбу помещают в теплую воду и помешивают. Только после растворения и охлаждения раствор доливают водой до 1 литра. Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла. Диазореактив II — натрия нитрит, 5 грамм/литр (0,07 моль/литр): 0,5 грамма нитрита натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 миллилитров и доливают водой до метки. Реактив стабилен в течение 2—3 недель при хранении в посуде из темного стекла. Перед работой смешивают 10 миллилитров диазореактива I и 0,3 миллилитра диазореактива II.

9.  Билирубин для построения калибровочного графика, 800 миллиграмм/литр, или 1 368 мкмоль/литр. Коммерческие препараты кристаллического билирубина содержат разные примеси, которые могут мешать реакции азосочетания. Рекомендуется использовать набор Био-Ла-Тест «Билирубин-эталон», содержащий билирубин высокой степени чистоты с коэффициентом молярной экстинкции не менее 6,05 х 104 литра при 453 нм и растворении в хлороформе. Растворы билирубина нестойкие, поэтому их готовят с добавлением белка в качестве стабилизатора. Коммерческие препараты билирубина не связаны с глюкуроновой кислотой.

10.  Натрия карбонат, 0,1 моль/литр: 10,6 грамма безводного NaCO3 растворяют и доливают до 1 литра водой.

11.  Уксусная кислота, 4 моль/литр: 25 миллилитров ледяной уксусной кислоты доливают до 100 миллилитров водой.

Ход определения билирубина

В 3 пробирки (2 опытные пробы и холостая) вводят реактивы, Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5—10 минут после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют стоять 20 минут, после чего измеряют на фотометре. При дальнейшем стоянии окраска не изменяется.

Измерение проводят при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 сантиметров против воды. Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы.

Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина.

Забор крови. Одевают резиновые перчатки, обрабатывают 70о С спиртом. Участок кожи пальца очищают ватным шариком, смоченным 70о С спиртом. Левой рукой захватывают четвертый палец левой руки пациента слегка сдавливая мякоть пальца. В правую руку берут стерильный скарификатор и держа его перпендикулярно относительно укола производят прокол на всю длину острия поперек дактилоскопических линий. Берут капилляр и вносят в выступившую каплю, набирают целый капилляр. Затем его с кровью помещают в пластиковую пробирку в которой находится реактив перемешивают, переворачивают пробирку и подписывают номер пробирки и бланка соответственно.

Определение сахара в крови. Для постановки анализа на капиллярный сахар берут 20 мкл крови и 200 мкл депротенизированного раствора, центрифугируют в течение 5 мин, затем отбирают 100 мкл надосадочной жидкости измеряют на аппарате «CLIMA» с добавлением рабочего раствора. Потом аппарат распечатывает результат.

Определение протромбинового индекса. Взвешиваем 50 г тромбопластина, высыпаем в ступку + 5,0 мг воды дист. и тщательно растираем пестиком в течение 3 мин. Затем взвесь сливается в центрифужную пробирку и центрифугируется при 1000 оборотов 5-7 мин. Центрифугат отсасывается. В пробирку: 0,2 мл 0,277% CaCl2, прогретого 5 мин, 0,1 мл 1% тромбопластина. Водяная баня при 37оС 30 с – 1 мин, 0,1 мл оксалатной плазмы. После добавления плазмы засекаем время образования сгустка. Расчет: активность тромбопластина в сек. делим на время свертываемости больного в сек. и умножаем на 100% (норме 93-107%).

Определение фибриногена. Подготовка плазмы пациента и контролей: 10 мкл плазмы и 190 мкл буфера. Реагент: 5 мл дистиллированной воды на флакон «Sta Fibrinogen». Поставить стрип в инкубатор. Разложить шарики. Размешиваем подготовленные образцы по 50 мкл начиная с первой кюветы и нажать таймер инкубатора. После сигнала переставляют стрип в измерительную ячейку. Активировать пипетку. Разливают рабочий реагент 50 мкл (на пипетке 1,25 мл-позиция 2). Анализатор распечатывает результаты. Норма: фибриноген 2,0-4,0 г/л.

Забор крови для проведения реакции микропреципитации. Для постановки реакции кровь берут из пальца. Перед взятием крови в пробирку вносят 5,0% - ный раствор натрия лимоннокислого, взятого капилляром аппарата Панченкова до метки «50». Затем тем же капилляром набирают кровь дважды до отметки «0» и вносят в ту же пробирку, перемешивают с раствором натрия лимоннокислого и центрифугируют ( если необходимо вскоре после взятия крови приступить к исследованию) при 2500-3000 0б/мин в течение 10-15 минут. При постановке реакции с сывороткой кровь берут из вены в объеме 5-10 мл, отделяют ее от сгустка, инактивируют при температуре (56±)о С в течение 30 мин и используют в реакции.

Проведение реакции микропреципитации. На обычное стекло или углубление пластинки из плексигласа наносят 3 капли нативной плазмы или инахтивированной сыворотки, затем добавляют 1 каплю антигенной эмульсии. Ингредиенты перемешивают покачиванием стекла в течение 5 мин, затем в каждую каплю эмульсии добавляют по три капли 0,9% раствора натрия хлористого, вновь перемешивают покачиванием стекла и оставляют при комнатной температуре на 5 мин (оптимальный температурный режим реакции t 23-28оС).

Учет результатов реакции

Результаты реакции учитываются при освещении не ниже 300 люкс. При исследовании плазмы или инактивированной сыворотки от больных сифилисом наблюдается положительная реакция в виде выпадения хлопьев разной величины, а с плазмой или инактивированной сывороткой от здоровых ли наблюдается отрицательная реакция в виде опалесценции.

Определение диастазы в моче В пробирки: опыт и контроль наливают 1,0 крахмала, инкубируется 5 мин при температуре 37оС. В другую пробирку 4,5 физраствор и 0,5 мочи размешивают. Набрать 0,02 мочи и ввести в крахмал затем ставить в термостат на 7,5 мин. Затем добавляют йод 1,0 (опыт и контроль). Нормальн. 1,0 + дистиллированной воды 8,0.

Контроль: 1,0 крахмал

1,0йод

8,0 дистилированной воды

После разведения стоит 5 мин смотрят на ФЭКе. Светофильтр 670, чувствительность 2.

Разведение в 20 и 50 раз делают, если диастаза выше 1000

В 20 раз: 0,5 разведение в 10 раз мочи + 0,5 физраствора

В 50 раз: 0,5 разведение в 10 раз мочи + 2,0 физраствора

В 100 раз: 500 мл в 50 раз + 500 физраствора