9. Билирубин для построения
калибровочного графика, 800 миллиграмм/литр,
или 1 368 мкмоль/литр. Коммерческие препараты
кристаллического билирубина содержат
разные примеси, которые могут мешать
реакции азосочетания. Рекомендуется
использовать набор Био-Ла-Тест «Билирубин-эталон»,
содержащий билирубин высокой степени
чистоты с коэффициентом молярной экстинкции
не менее 6,05 х 104 литра при 453 нм и растворении
в хлороформе. Растворы билирубина нестойкие,
поэтому их готовят с добавлением белка
в качестве стабилизатора. Коммерческие
препараты билирубина не связаны с глюкуроновой
кислотой.
10. Натрия карбонат, 0,1 моль/литр:
10,6 грамма безводного NaCO3 растворяют
и доливают до 1 литра водой.
11. Уксусная кислота, 4 моль/литр:
25 миллилитров ледяной уксусной кислоты
доливают до 100 миллилитров водой.
Ход определения
билирубина
В 3 пробирки (2 опытные пробы
и холостая) вводят реактивы, как указано
в таблице.
Диазореакция
Ингредиенты |
Опытная проба, мл |
Холостая проба, мл |
Общий билирубн |
Связанный билирубин |
Сыворотка |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
Кофеиновый реактив |
1,75 |
— |
1,75 |
Раствор хлорида натрия |
— |
1,75 |
0,25 |
Диазосмесь |
0,25 |
0,25 |
— |
Для определения связанного
билирубина измерение проводят спустя
5—10 минут после добавления диазосмеси,
так как при длительном стоянии в реакцию
вступает несвязанный билирубин. Для определения
общего билирубина пробу для развития
окраски оставляют стоять 20 минут, после
чего измеряют на фотометре. При дальнейшем
стоянии окраска не изменяется.
Измерение проводят при длине
волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете
с толщиной слоя в 0,5 сантиметров против
воды. Из показателей, полученных при измерении
общего и связанного билирубина, вычитают
показатель холостой пробы.
Расчет производят по калибровочному
графику. Находят содержание общего и
связанного билирубина.
Построение калибровочного
графика
Способ I — Шелонга—Венде с
использованием стабилизирующего свойства
белка сыворотки крови. Основной раствор
билирубина: в колбе вместимостью 50 миллилитров
растворяют 40 миллилитров билирубина
в 30—35 миллилитров 0,1 моль/литр раствора
карбоната натрия Na2C03. Хорошо взбалтывают,
не допуская образования пузырьков.
Доводят до 50 миллилитров 0,1
моль/литр раствором Na2C03 и несколько
раз перемешивают. Раствор стоек только
в течение 10 минут от начала приготовления.
В дальнейшем происходит окисление билирубина.
Рабочий раствор билирубина:
к 13,9 миллилитра свежей негемолизйрованной
сыворотки здорового человека добавляют
2 миллилитров свежеприготовленного основного
раствора билирубина и 0,1 миллилитров
4 моль/литр раствора уксусной кислоты.
Хорошо перемешивают.
При этом выделяются пузырьки
углекислого газа. Рабочий раствор стоек
в течение нескольких дней.
Этот раствор содержит точно
на 100 миллиграмм/литр, или 171 мкмоль/литр,
билирубина больше, чем сыворотка, взятая
для приготовления раствора.
Чтобы исключить при расчетах
количество билирубина, содержащегося
в этой сыворотке, при измерении на фотометре
из величин экстинкции калибровочных
проб вычитают величины экстинкции соответствующих
разведений компенсационной жидкости.
Для приготовления компенсационной
жидкости смешивают 13,9 миллилитра той
же сыворотки, которая использовалась
для приготовления калибровочного раствора
билирубина, 2 миллилитра 0,1 моль/литр раствора
карбоната натрия и 0,1 миллилитра 4 моль/литр
раствора уксусной кислоты.
Для построения калибровочного
графика готовят ряд разведений с различным
содержанием билирубина.
К полученным разведениям прибавляют
по 1,75 миллилитра кофеинового реактива
и по 0,25 миллилитра диазосмеси. При появлении
помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного
раствора едкого натра. Измерение проводят
при тех же условиях, что и в опытных пробах,
через 20 минут.
Из компенсационной жидкости
готовят разведения, аналогичные калибровочным,
и далее обрабатывают их так же, как калибровочные
пробы.
Определения связанного
билирубина
Номер пробирки |
Рабочий раствор билирубина,
мл |
Изотонический раствор NaCl, мл |
Количество билирубина в пробе |
Концентрация билирубина в
сыворотке крови, мкмоль/л |
мг |
мкмоль |
1 |
0,05 |
0,45 |
0,005 |
0,00855 |
17,1 |
2 |
0,1 |
0,4 |
0,01 |
0,0171 |
34,2 |
3 |
0,15 |
0,35 |
0,015 |
0,02565 |
51,3 |
4 |
0,2 |
0,3 |
0,02 |
0,0342 |
68,4 |
5 |
0,25 |
0,25 |
0,025 |
0,04275 |
85,5 |
Способ II — калибровочный график
строится по готовому набору реактивов
«Билирубин-эталон» («Лахема»). Набор Био-Ла-Тест
«Билирубин-эталон» включает:
- билирубин лиофилизированный
(точная концентрация били рубина приведена
на этикетке флакона);
- альбумин лиофилизированный.
Способ приготовления растворов
билирубина указан в инструкции к набору.
Калибровочная кривая линейка
до 170 мкмоль/литр.
Примечание
На правильность метода влияет
способ построения калибровочной кривой.
Ряд веществ — гидрокортизон,
андрогены, эритромицин, глюкокортикоиды,
фенобарбитал, аскорбиновая кислота —
вызывают интерференцию.
Билирубин мочи определяют
с помощью реакции Гаррисона это качественная
реакция. Этот метод дает возможность
определить даже незначительное количество
билирубина в моче, что имеет большое значение
для ранней диагностики острого гепатита.
Если при желтухе моча бывает темного
цвета (не содержит билирубина), то следует
предположить гемолитическую желтуху.
Повышение уровня уробилина в моче свидетельствует
о серьезном поражении клеток печени.
Метод Гаррисона-Уатсона-Хавкинсона
(модификация пробы Фуше)
Реактивы:
Насыщенный раствор хлорида
бария.
Реактив Фуше: 25 г ТХУ растворяют в 100 мл дистиллированной воды и прибавляют 1 г хлорного железа.
15% раствор хлорида бария: к 10 мл мочи прибавляют 5 мл хлорида бария, смешивают, фильтруют.
Ленту фильтровальной бумаги,
пропитанную хлоридом бария и высушенную
на воздухе, погружают на 15 с в мочу, сушат,
а затем наносят 2 капли реактива Фуше.
При положительной реакции - зеленоватые,
зеленые или сине-зеленые пятна.
Для количественного определения
уробилина применяют реакцию Эрлиха и
метод флюоресценции Адлера. В норме суточное
количество уробилина составляет 20-70 мг.
При патологических состояниях, когда
желчь не поступает в кишечник (закупорка
ОЖП, полное нарушение экскреции желчи),
в моче не выявляется уробилин. В таких
случаях появление в моче уробилина является
признаком выздоровления.
Реактив Эрлиха: 2 г р-диметиламинобензальдегида
растирают в ступке с 10 мл крепкой соляной
кислоты, доливают соляной кислотой до
50 мл и дистиллированной водой до 100 мл.
Ход определения. К 1 мл мочи добавляют 1 каплю
реактива Эрлиха, отмечают время. Окрашивание
в красный цвет мочи в первые 30 с означает
увеличение уробилиновых тел - положительная
проба. Развитие окраски по истечении
60 с или ее отсутствие указывает на их
нормальное содержание.
Положительная
реакция выявляет четыре уробилиногеновые
тела.
Примечание:
реакция положительная при выделении
с мочой порфобилиногена, больших количеств
уророзеина, скатола, индола и ряда лекарственных
веществ (триптофан, неотропин, соединения,
содержащие пиридиновое кольцо); при употреблении
пищи, богатой хлорофиллом. Билирубин,
индикан, сульфаниламиды, парааминосалициловая
кислота, экстракт сенны маскируют реакцию
Определение стеркобилина в кале. Осуществляется
качественным тестом Шмидта и количественным
— Адлера. Суточное количество стеркобилина
оставляет 200-300 мг. При ОЖ в кале стеркобилин
либо отсутствует, либо значительно уменьшается
его количество. При гемолитической желтухе
содержание его в кале увеличивается,
а при паренхиматозной желтухе оно бывает
в пределах нормы.
Проба Шмидта.
Реактивы: раствор двухлористой ртути (HgCl2 — хлорид
ртути, сумма), 70 г/л раствора. Растворяют
при кипячении, после охлаждения фильтруют.
Ход определения. Комочек кала величиной с лесной орех
растирают в фарфоровой чашечке или пробирке
с 3—4 мл раствора двухлористой ртути,
закрывают крышкой или пробкой и оставляют
при комнатной температуре в вытяжном
шкафу на сутки. Контрольную пробу ставят
так же, как опытную, но вместо двухлористой
ртути берут воду.
В присутствии стеркобилина в опытной
пробе появляется розовое окрашивание.
Оценку результатов можно провести немедленно,
если подогревать пробирки с опытной и
контрольными пробами на пламени горелки.
При наличии билирубина образуется зеленое
окрашивание. В норме реакция положительная.
Метод Адлера.
Ход определения. Из суточного количества кала
берут 10 г и растирают в ступке с 20 мл петрелейного
эфира в течение 3—5 мин. для извлечения
индола и скатола (также дающих флуоресценцию).
Обработку кала эфиром производят до исчезновения
в экстракте реакции флуоресценции с Zn
(CH3COO)2. К промытому
эфиром калу добавляют 1 г уксуснокислого
цинка (в порошке), 10 мл 96% спирта и 3 капли
1% спиртового раствора йода; тщательно
перемешивают и фильтруют. Фильтрат разводят
в 10 и 100 раз специальной жидкостью (20 г
уксуснокислого цинка растворяют в 100
мл дистиллированной воды и приливают
100 мл спирта).
Пипеткой разливают убывающие
количества исходного и разведенного
(1:10 и 1:100) фильтрата в ряд пробирок и доливают
каждую из них разводящей жидкостью до
объема 2 мл (табл.); зеленая флуоресценция
говорит о наличии стеркобилина. Отмечают,
в какой из пробирок флуоресценция наименее
интенсивна, и по таблице находят содержание
в данном разведении стеркобилина в миллиграмм-процентах.
Эту величину умножают на вес суточного
количества кала и делят на 100 (для перевода
миллиграмм-процентов в миллиграммы).
Пересчет содержания стеркобилина
в зависимости от разведения фильтрата |
Исходный фильтрат |
Разведение 1:1 |
Разведение 1:100 |
Фильтрат в мг |
разводящая жидкость
в мл |
содержание стеркобилина
в мг% |
Фильтрат в мг |
разводящая жидкость
в мл |
содержание стеркобилина
в мг% |
Фильтрат в мг |
разводящая жидкость
в мл |
содержание стеркобилина
в мг% |
2,00 |
- |
0,17 |
0,80 |
1,20 |
4,25 |
0,80 |
1,20 |
42,5 |
1,50 |
0,50 |
0,22 |
0,66 |
1,34 |
5,10 |
0,66 |
1,34 |
51,0 |
1,00 |
1,00 |
0,34 |
0,57 |
1,43 |
5,95 |
0,57 |
1,43 |
59,5 |
0,80 |
1,20 |
0,43 |
0,50 |
1,50 |
6,80 |
0,50 |
1,50 |
68,0 |
0,50 |
1,50 |
0,68 |
0,40 |
1,60 |
8,50 |
0,40 |
1,60 |
85,0 |
0,40 |
1,60 |
0,85 |
0,30 |
1,70 |
11,00 |
0,30 |
1,70 |
110,0 |
0,30 |
1,70 |
1,10 |
0,26 |
1,74 |
12,75 |
|
|
|
0,26 |
1,74 |
1,28 |
0,20 |
1,80 |
17,05 |
|
|
|
0,20 |
1,80 |
1,70 |
0,16 |
1,84 |
21,25 |
|
|
|
0,16 |
1,84 |
2,13 |
0,13 |
1,87 |
25,50 |
|
|
|
0,13 |
1,87 |
2,55 |
0,10 |
1,90 |
34,00 |
|
|
|
0,10 |
1,90 |
3,40 |
|
|
|
|
|
|
Пример: минимальная флуоресценция
отмечена при разведении в 100 раз в пробирке
с 0,3 мл фильтрата и 1,7 мл разводящей
жидкости. В таблице это соответствует
110 мг% стеркобилина. Суточный вес кала
200 г. Т. о., суточное выделение стеркобилина
(110×200)/100 составляет 220 мг.
Исследование белкового
обмена.
Как известно, в печени
синтезируются плазменные белки
(альбумин, фибриноген, протромбин, С-реактивный
белок, гликопротеин, трансферин и церулоплазмин).
Иммуноглобулины (γ-глобулины) синтезируются
иммунными метками (плазматические клетки)
и лимфоцитами. Заболевания печени часто
являются одной из главных причин уменьшения
синтеза альбуминов в сыворотке. Для определения
количества белка в сыворотке крови применяются
аналитические методы. В норме количество
общего белка составляет 7-8,2%, из которого
3,5-5,12% — альбумины и 2,5-3,52% — глобулины.
Соотношение альбуминов и глобулинов
равно 1,5:1. Для исследования белков сыворотки
крови часто применяется метод электрофореза
(электрофоретический анализ). При этом
выявляются отдельные фракции общего
белка, между которыми существует следующее
соотношение: альбумины — 55-65%, α1-глобулины
— 2,1-3,5%, α2-глобулины
— 7,2-9,1%, β-глобулины — 9,1-12,7% и γ-глобулины
— 16,6-19%.
Осадочные реакции отражают
баланс различных белковых фракций сыворотки.
Нарушение его главным образом обусловлено
повышением концентрации γ-глобулинов
и липопротеиновых фракций.
Исследование свертывающей
системы.
При острых и хронических заболеваниях
печени отмечаются нарушения свертывающей
системы крови, что связано с нарушением
синтеза факторов, принимающих участие
в данном процессе. При поражении печени
нарушается синтез таких прокоагулянтов,
как протромбин (фактор 1), проакселерин (фактор 2), проконвертин
(фактор 7) итд. Эти нарушения часто сочетаются
с тромбоцитопенией.
Определение протромбина.
Распространенным методом определения
протромбина плазмы является метод Квике.
Протромбиновое время в норме равно 13-15
с, а протромбиновый показатель —100 %. Протромбиновый
и другие показатели свертываемости крови
снижаются при механической желтухе и
холангите. В таких случаях возникает
склонность к кровоточивости. Это состояние
ликвидируется путем внутривенного введения
витамина К. При острых и хронических заболеваниях
печени пораженные клетки печени не в
состоянии в достаточном количестве выработать
фибриноген, протромбин. При уменьшении
количества фибриногена, протромбина,
V и VII факторов свертываемости и значительной
потере крови нередко возникает фибринолиз.
Количество фибриногена уменьшается при
тяжелых поражениях печени, при повышении
фибринолитической активности и т.д.
Для исследования свертывающей и противосвертывающей
систем крови применяются методы тромбоэластографии
и определение сывороточных иммуноглобулинов
(lgA, lgM, lgG(М)). Для этого применяется метод
иммуноэлектрофореза. В диагностическом
плане имеет значение определение циркулирующих
в крови тканевых антител. В настоящее
время это осуществляется с помощью непрямого
иммунофлюоресцентного метода.