Методы биохимического исследования заболеваний печени

•  Минеральные вещества (железо, медь, хром). Например, при гемохроматозе в ткани печени накапливается железо, развиваются гепатомегалия и цирроз.

Нарушение дезинтоксикационной функции печени характеризуется снижением эффективности процессов обезвреживания в печени: эндогенных токсинов (фенолов, скатолов, аммиака, путресцина, кадаверинов, низкомолекулярных жирных кислот, сульфатированных аминокислот и др.) и экзогенных ядовитых веществ (например, ядохимикатов, ЛС, токсинов грибов и микробов).

Нарушение желчеобразования и желчевыделения проявляется развитием желтух и нарушений пищеварения.

Печёночная кома

При прогрессирующей печёночной недостаточности развивается кома.

Причины печёночной комы: интоксикация организма в связи с повреждением и гибелью значительной массы печени (при печёночнокле- точной, или паренхиматозной коме) или сбросе крови из системы портальной вены в общий кровоток, минуя печень (при шунтовой, или обходной коме).

Патогенез. Основные факторы патогенеза печёночных ком: гипогликемия, ацидоз, дисбаланс ионов, эндотоксинемия, расстройства кровообращения, полиорганная недостаточность.

Желтуха - избыточное содержание в крови, интерстициальной жидкости и тканях компонентов жёлчи, обусловливающее желтушное окрашивание кожи, слизистых оболочек и мочи.

Все виды желтух объединены одним признаком - гипербилирубинемией, от которой зависит степень и цвет окраски кожи: от светло-лимонной до оранжево-жёлтой, зелёной или оливково-жёлтой (пожелтение кожи и склер начинается при концентрации билирубина более 26 ммоль/л).

Этиология:

♦ Инфекционные причины: вирусы, бактерии, плазмодии.

♦ Неинфекционные причины: органические и неорганические гепатотоксические вещества (например, четырёххлористый углерод, этанол, парацетамол и др.), гепатотропные АТ и цитотоксические лимфоциты, новообразования.

Стадии паренхиматозной желтухи.

Характер и выраженность нарушений функций печени зависит от степени альтерации и массы повреждённых гепатоцитов. Характер расстройств желчеобразования и желчевыведения и степень их выраженности на разных этапах (стадиях) патологического процесса различны.

Первая стадия (преджелтушная)

Причины: в гепатоцитах снижается активность ферментов, разрушающих уробилиноген; повреждение мембран гепатоцитов, снижение активности глюкуронилтрансферазы.

Проявления: уробилиногенемия и уробилиногенурия, увеличение содержания «печёночных» ферментов в крови.

Вторая стадия (желтушная)

Причины. Для желтушной стадии характерно дальнейшее усугубление альтерации гепатоцитов и их ферментов. Это приводит к нарушению работы «билирубинового конвейера». Расстройство этого механизма, в совокупности с повреждением мембран клеток, обусловливает нарушение однонаправленного транспорта билирубина. Проявления: выход прямого билирубина в кровь и развитие билирубинемии, фильтрация прямого билирубина почками и его экскреция с мочой, попадание компонентов жёлчи в кровь и развитие холемии.

Третья стадия

Причины: прогрессирующее уменьшение активности глюкуронилтрансферазы гепатоцитов приводит к нарушению трансмембранного переноса конъюгированного билирубина в гепатоциты и торможению процесса глюкуронизации билирубина.

 

Проявления

♦ Нарастание уровня непрямого билирубина в крови.

♦ Уменьшение содержания в крови прямого билирубина (как результат подавления реакции глюкуронизации).

♦ Снижение концентрации стеркобилиногена в крови, моче и экскрементах.

♦ Уменьшение содержания уробилиногена в крови и, как результат - в моче. Является результатом малого поступления прямого билирубина в желчевыводящие пути и кишечник.

♦ Усугубление повреждения структур и ферментов гепатоцитов с нарастанием холемии, сохранением ферментемии и гиперкалиемии, прогрессированием печёночной недостаточности, что чревато развитием комы.

Энзимопатические желтухи

Различают энзимопатические желтухи наследуемые (первичные) и приобретённые (вторичные)

•  Первичные энзимопатии развиваются при генных дефектах ферментов и белков, обеспечивающих метаболизм пигментного обмена в гепатоцитах. Существует несколько нозологических форм, относящихся к этой группе желтух: синдром Жильбера (семейная негемолитическая желтуха), синдром Дабина-Джонсона, синдром Криглера-Найяра, синдром Ротора и другие.

•  Приобретённые (вторичные) нарушения свойств ферментов, участвующих в метаболизме жёлчных пигментов и синтезе компонентов мембран гепатоцитов развиваются вследствие интоксикации организма (например, этанолом, четырёххлористым углеродом, парацетамолом, хлорамфениколом), инфекционных поражений печени (например, вирусами); повреждений гепатоцитов АТ, цитотоксическими лимфоцитами и макрофагами.

Внепечёночные желтухи: Гемолитическая желтуха.

Причины

♦ Внутри- и внесосудистый гемолиз эритроцитов.

♦ Гемолиз эритроцитов и их предшественников в костном мозге.

♦ Синтез неконъюгированного билирубина из негемоглобинового гема в печени, костном мозге.

♦ Образование избытка неконъюгированного билирубина при инфаркте органов, скоплении крови в тканях, органах, полостях тела.

 

Проявления

♦ Признаки повреждения гепатоцитов: симптомы печёночной недостаточности, присоединение паренхиматозной желтухи.

♦ Признаки гемолиза эритроцитов: анемия, гемическая гипоксия, гемоглобинурия, уробилиногенемия и уробилиногенурия, повы-

шение в крови концентрации неконъюгированного билирубина, увеличение концентрации стеркобилиногена в крови, моче, кале.

Механическая желтуха.

Этиология:

Механическая желтуха развивается при стойком нарушении выведения жёлчи по жёлчным капиллярам (что приводит к внутрипечёноч- ному холестазу), по жёлчным протокам и из жёлчного пузыря (с развитием внепечёночного холестаза). Причинные факторы:

♦ Закрывающие желчевыводящие пути изнутри (например, конкременты, опухоли, паразиты).

♦ Сдавливающие жёлчные пути снаружи (например, новообразования головки поджелудочной железы или большого дуоденального сосочка; рубцовые изменения ткани вокруг желчевыводящих путей; увеличенные лимфатические узлы).

♦ Нарушающие тонус и снижающие моторику стенок желчевыводящих путей (дискинезии).

Указанные факторы обусловливают повышение давления в жёлчных капиллярах, перерастяжение (вплоть до микроразрывов) и повышение проницаемости стенок желчеотводящих путей, диффузию компонентов жёлчи в кровь. При этом развивается билиарный гепатит.

Проявления механической желтухи.

Для механической (подпечёночной, застойной, обтурационной) желтухи характерно развитие холемии и ахолии.

• Синдром холемии (желчекровия) - комплекс расстройств, обусловленных появлением в крови компонентов жёлчи, главным образом жёлчных кислот (гликохолевой, таурохолевой и др.), прямого билирубина и холестерина.

Синдром ахолии - состояние, характеризующееся значительным уменьшением или прекращением поступления жёлчи в кишечник, сочетающееся с нарушением полостного и мембранного пищеварения

 

2. Лабораторная диагностика заболевания печени.

Исследование пигментного обмена.

Среди тестов, определяющих пигментный обмен, важное место занимает определение билирубина крови. С этой целью более часто применяется прямая реакция Ван ден Берга. Полученные показатели при этом отражают связанный билирубин. Непрямая реакция отражает сумму несвязанной и связанной фракций билирубина. Концентрация несвязанного билирубина определяется вычитанием количества связанного из общего количества билирубина. В норме общий билирубин сыворотки составляет 1 мг%. Концентрация связанного билирубина в ней менее 0,5 мг%.  
 
Для определения количества билирубина применяются методы Эндрасека и Клегорна. Более точными считаются хроматографические методы отделения фракции сывороточного билирубина. Однако из-за сложности широкого распространения они не получили. Определение фракции билирубина дает возможность уточнить характер желтухи, степень ее выраженности и контролировать в течение патологического процесса.  
 
При отдельных видах гемолитической желтухи повышается концентрация непрямого билирубина, однако уровень общего билирубина продолжает оставаться в пределах нормы (3-4 мг%).  
 
При обтурационной желтухе значительно повышается уровень билирубина, за исключением прямой фракции. При паренхиматозной (гепатоцеллюлярной) желтухе повышается уровень прямого и непрямого (связанного и свободного) билирубина. Следует отметить, что эти изменения не носят абсолютного характера. Важное значение имеет исследование пигментного обмена в моче и кале.

Определение билирубина крови. Реакция Ван Ден Берга.

Принцип реакции основан на свойстве спирта осаждать белки сыворотки крови, извлекая в то же время из нее желчные пигменты. Билирубин человеческой сыворотки имеется в двух видах. Незначительное количество билирубина содержится в нормальной сыворотке, но от прибавления к ней диазореактива билирубин не окрашивается. Один вид билирубина при некоторых заболеваниях, например в случае застойной желтухи, при прибавлении к сыворотке диазореактива получает розово-красное окрашивание. Иногда это окрашивание происходит сразу (в течение 30 секунд) и интенсивно — это прямая быстрая реакция; окрашивание может появиться спустя 3—4 минуты, тогда это прямая замедленная реакция. При другом виде билирубина получается красное окрашивание от прибавления диазореактива только тогда, когда в сыворотке осаждают белок спиртом. Получается так называемая непрямая реакция. Прямая реакция. В пробирку вливают 1 мл сыворотки, 2 мл дистиллированной воды и 0,25 мл свежеприготовленного диазореактива. Содержимое пробирки хорошо смешивают. При положительном результате получается розово-красное окрашивание. От добавления 1—2 капель крепкой соляной кислоты указанная окраска переходит в сине-фиолетовую. Отсутствие в пробирке окраски жидкости указывает на отрицательную прямую реакцию. Непрямая реакция. Смешивают 1 мл сыворотки с 2 мл 96° спирта и центрифугируют. К полученной прозрачной жидкости добавляют 0,25 мл диазореактива. При положительной непрямой реакции в пробирке получается интенсивное красное окрашивание. Обе эти реакции можно произвести с меньшим количеством сыворотки при соблюдении указанных соотношений. Количество билирубина определяют при сравнении со стандартным раствором в колориметре.

 

Реактивы:

1. Спирт ректификат 96°.

2. Диазореактив Эрлиха, состоящий из следующих двух растворов, которые смешивают к моменту постановки реакции. Раствор I: сульфаниловой кислоты — C6H4(NH2)S03H 2H20 — 1 г, соляной кислоты (удельного веса 1,12) — 15 мл, дистиллированной воды — 1 л. Сульфаниловую кислоту смешивают в литровой колбе с соляной кислотой и небольшим количеством дистиллированной воды, а затем нагревают до растворения, после чего прибавляют остальную воду. Раствор II: 0,5% азотнокислого натрия (NaN02). Диазореактив Эрлиха состоит из 8 мл раствора 1 и 0,25 мл раствора II. Раствор II не должен содержать избытка азотистой кислоты (отсутствие посинения йодо-калиево-крахмальной бумажки).

 

3. Стандартный раствор 2,161 г сернокислого кобальта (CoS04) растворяют  в 100 мл воды. Ввиду того, что продажный  препарат содержит много воды, его высушивают методом Пинкуссена (Pincussen).

Препарат высушивают нагреванием до слабо-красного каления и по охлаждении приготовляют 2% раствор, по окраске соответствующий раствору билирубина 1:200 000 (0,5 мг%). Раствор устойчив.

Оборудование. Две пипетки Мора в 1 мл для крови и в 2 мл для спирта. Градуированные пипетки: одна в 1 мл и две по 2 мл Пробирки центрифужные. Колориметр.

 Постановка реакции. Для  реакции необходимо 1—2 мл сыворотки, для чего надо взять 4—5 мл крови.

Кровь, взятую из вены, для свертывания ставят на 3—4 часа Полученную прозрачную сыворотку в количестве 1 мл сливают в центрифужную пробирку, прибавляют 2 мл спирта, жидкости хорошо смешивают и центрифугируют.

1 мл отцентрифугированной прозрачной жидкости вливают в сосуд колориметра, прибавляют 0,25 мл реактива 2 (диазореактив) и 0,5 мл спирта. Получается смесь от розоватого до красного цвета. В пустой клин или стаканчик колориметра наливают стандартный раствор (3) и через 10 минут колориметрируют.

 При образовании сине-фиолетового  оттенка (от избытка кислотности  смеси) к смеси прибавляют одну  каплю спиртового раствора аммиака, при этом получается красный  цвет. От избытка щелочи получается  желтоватый оттенок, в таких случаях  к смеси прибавляют одну каплю  соляной кислоты в разведении 1 : 20.

 

Определение билирубина в крови - унифицированный метод по диазореакции в присутствии акселератора (метод Ендрассика-Клеггорна-Грофа).

Принцип метода определения билирубина.

Под воздействием НСl разрывается тетрапирроловая связь билирубина, в результате чего образуются два дипиррола, которые диазотируются диазобензосульфоновой кислотой с образованием розово-фиолетового азобилирубина.

Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный билирубин реагирует после добавления кофеинового реактива.

Необходимые реактивы для определения билирубина

1.  Кофеин.

2.  Натрия бензонат.

3.  Натрия ацетат 3-водный.

4.  Кофеиновый реактив: 5 грамм кофеина, 7,5 грамм бензоната натрия, 12,5 грамма ацетата натрия растворяют в 90 миллилитров воды, нагревают до температуры 50—60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доливают водой до 100 миллилитров. Раствор стабилен в течение 2 недель.

5.  Натрия хлорид, 154 ммоль/литр (изотонический раствор): 0,9 грамма хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 миллилитров и доливают до метки водой.

6.  НСl концентрированная.

7.  Сульфаниловая кислота.

8.  Диазосмесь. Диазореактив I:5 грамм сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300—400 миллилитрах воды, прибавляют 15 миллилитров концентрированной НС1. Если сульфаниловая кислота полностью не растворяется, колбу помещают в теплую воду и помешивают. Только после растворения и охлаждения раствор доливают водой до 1 литра. Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла. Диазореактив II — натрия нитрит, 5 грамм/литр (0,07 моль/литр): 0,5 грамма нитрита натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 миллилитров и доливают водой до метки. Реактив стабилен в течение 2—3 недель при хранении в посуде из темного стекла. Перед работой смешивают 10 миллилитров диазореактива I и 0,3 миллилитра диазореактива II.