Методы биохимического исследования заболеваний печени

Протромбиновый тест.

Принцип. Что из себя представляет в общих чертах протромбиновый тест. Методика его была предложена в 1935 году Армандом Квиком и соавт. и получила распространение как "время по Квику" или "тест по Квику". Как известно, ПТ симулирует в пробирке работу внешнего пути свертывания, в соответствии с чем при рекальцификации тромбопластин, выполняя роль тканевого фактора, активирует фактор VII. Затем, с участием факторов X и V, протромбин (фактор II) активируется в тромбин, коагулирующий фибриноген. Таким образом определяется время свертывания рекальцифицированной плазмы (или крови) при добавлении к ней тканевого тромбопластина определенной активности и чувствительности к дефициту факторов протромбинового комплекса(VII, X, V, II).

Реактивы: Тромбопластин.

Материал для исследования: Цитратная бедная тромбоцитами плазма.

Ход определения: Предварительно, за 10 мин до начала исследования, разведенную (в соответствии с рекомендацией фирмы-изготовителя) тромбопластин-кальциевую смесь помещают на водяную баню при +37°С и оставляют там до окончания работы.  
Определение протромбинового времени по Квику. Исследуемую плазму, в объеме 0,1 мл, прогревают в пробирке на водяной бане (или кювете коагулометра) при +37°С. Через 30 с (60 с в кювете коагулометра) добавляют 0,2 мл прогретой до +37°С тромбопластин-кальциевой смеси, включают секундомер и определяют время свертывания. Точно также определяют ПВ в контрольной нормальной плазме. 
Вариант метода для капиллярной крови. После прокола кожи пальца скарификатором, первую каплю крови не используют, а последующие 0,09 мл крови немедленно смешивают в пробирке (или кювете коагулометра) с 0,01 мл 3,8% раствора цитрата натрия. У доношенных новорожденных 3-5 дней жизни в это количество цитрата добавляют 0,10-0,11 мл крови. Кровь и раствор цитрата тщательно смешивают. Затем к 0,1 мл стабилизированной крови добавляют 0,1 мл тромбопластин-кальциевой смеси. Температура смешиваемых компонентов должна быть +37°С. Регистрируют время свертывания.  
Определение протромбинового времени в крови для обеспечения должной точности должно проводиться на коагулометре с механическим принципом регистрации результатов, например коагуляторе фирмы Behnk Electronik, Германия (Тромбостат-1 или Тромбостат-2).

 
Представление результатов теста

Результат учитывают в секундах и выражают по одному из следующих вариантов: 
1. Указывают протромбиновое время (ПВ) в секундах с указанием контрольных значений, полученных при исследовании контрольной нормальной плазмы. Для мануального определения оптимальная активность реактива в норме соответствует 12-15 с, для коагулометров - 11-14 с. 
 
2. В отечественной литературе в течение длительного времени использовался расчет протромбинового индекса (ПИ) по следующей формуле: 
ПИ = (ПВ контрольной нормальной плазмы /ПВ больного) x 100%  
 
Однако такая методика учета результатов устарела, не соответствует современным требованиям и маскирует активность используемого тромбопластина.  
 
3. В настоящее время приняты следующие варианты оценки результатов протромбинового (тромбопластинового) теста: 
 
Определяют протромбиновое отношение (ПО) в единицах по формуле:

ПО = (ПВ больного /ПВ контрольной нормальной плазмы)  
Для различных тромбопластинов ПО в норме составляет 0,7-1,1. 
 
Затем, для учета международного индекса чувствительности тромбопластина (МИЧ), возводят ПО степень МИЧ или ISI (указан в маркировке фирмой-изготовителем) и таким образом расчитывают 
международное нормализованное отношение 
(МНО или INR).  
Например, протромбиновое время плазмы больного, получающего антикоагулянты - 45 с. Протромбиновое время контрольной нормальной плазмы - 12,7 с. МИЧ (или ISI), указанный в инструкции к тромбопластину - 1,08. 
Отсюда МНО для данного больного = ПОМИЧ = (45 : 12,7)^1,08 = 3,92. 
 
Нормальное МНО (у здоровых людей) меньше 1,3. При лечении непрямыми антикоагулянтами МНО поддерживают на уровне 2,0-3,5 в зависимости от клинической ситуации. 
Таким образом, чем выше МНО, тем значительнее полученная гипокоагуляция и тем чаще и опаснее геморрагические осложнения. Вместе с тем, определение МНО, в сравнении с протромбиновым индексом, позволяет более точно подобрать дозу антикоагулянта и уменьшить риск кровотечений, связанных с его передозировкой. 
 
4. В тех случаях, когда индекс чувствительности тромбопластина не приведен, нередко применяется расчет активности факторов протромбинового комплекса (в процентах) по Квику, с использованием калибровочной кривой, построенной по результатам измерения ПВ в разведениях контрольной нормальной плазмы (описание методики и калибровочная сетка приводятся в инструкциях к соотвествующим коммерческим наборам для определения ПВ).

Исследование сывороточных ферментов. При заболеваниях печени и желчных путей меняется также уровень сывороточных ферментов, что свидетельствует о характере патологических процессов. В связи с этим большое значение приобретает исследование сывороточных ферментов. Повышение их уровня происходит при непосредственном переходе ферментов из клеток в общее русло кровообращения.  
 
Для определения щелочной фосфатазы часто используют методы Кинг—Армстронга или Бодановского. У здоровых лиц в 100 мл сыворотки крови активность щелочной фосфатазы колеблется от 1,3 до 5,5 единицы. Определение щелочной фосфатазы и лактат дегидрогеназы дает возможность дифференцировать характер желтухи.

Принцип метода определения щелочной фосфатазы

Щелочная фосфатаза (щелочная фосфогидролипаза моноэстеров ортофосфорной кислоты) расщепляет в метил-В-глюкаминовом буфере 4-нитрофенилфосфат с образованием 4-нитрофено-ла и фосфата. Щелочная фосфатаза (ЩФ) активирована хлоридом натрия. Мерой каталитической концентрации фермента является количество освобожденного 4-нитрофенола, который определяют фотометрически, либо кинетическим методом, либо методом постоянного времени после остановки ферментативной реакции ингибитором щелочной фосфатазы, который блокирует активный центр фермента.

Кинетическим методом можно без разведения анализировать сыворотки до каталитической концентрации щелочной фосфатазы (ЩФ) 30 мккат/л. Методом константного времени можно без разведения анализировать пробы до 7 мккат/л. При каталитической концентрации щелочной фосфатазы (ЩФ), превышающей эти величины, пробы следует развести физиологическим раствором и анализ произвести повторно (результат умножить на разведение). Объемы отдельных растворов и пробы можно модифицировать при условии соблюдения взаимных соотношений объемов, указанных в описании хода инкубационной смеси. Пределы активности щелочной фосфатазы (ЩФ) при температуре 37°С (мккат/л):

- мужчины — 0,90—2,29;

- женщины — 0,74—2,10;

- дети до 12 лет — 1,20—6,30.

Необходимые реактивы для определения щелочной фосфатазы:

1. n-нитрофениловый эфир фосфорной кислоты, динатриевая соль.

2. Соляная кислота, 0,001 моль/л.

3. n-нитрофенилфосфат натрия, 4 грамм/литр раствор в 0,001 моль/л раствора НО: 0,4 грамма n-нитрофенилфосфата помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают до метки 0,001 моль/л раствором НСl. В связи с тем, что в продаже чаще имеется бариевая соль n-нитрофенилфосфата, то перевод ее в натриевую соль осуществляется следующим способом: к навеске n-нитрофенилфосфата бария, соответствующей получению 9 грамм/литрраствора и помещенной в фарфоровую ступку, добавляют небольшими количествами 0,001 моль/л раствор НС1 в процессе растирания соли в ступке в течение 10 минут. Добавлением насыщенного раствора сульфата натрия (1 мл на 100 мл раствора) бариевую соль переводят в натриевую.

Через 5 минут полученный раствор n-нитрофенилфосфата натрия фильтруют в делительную воронку, где затем взбалтывают с равным объемом водонасыщенного бутилового спирта. После разделения слоев жидкости в делительной воронке (вверху — бутанол, внизу — постепенно обесцвечивающийся субстратный раствор) бутанол выливают, а субстратный раствор подвергают описанной выше процедуре очистки еще 2—3 раза, пока он не станет совершенно бесцветным. После бутанола производят экстракцию водонасыщенным эфиром 1—2 раза. Реактив не должен содержать свободного n-нитрофенола, отсутствие которого в субстратном растворе проверяется следующей пробой: к 1 мл субстратного раствора прибавляют 10 мл 0,02 моль/л раствора едкого натра и измеряют на фотоэлектроколориметре (ФЭКе) при длине волны 400—420 нм (фиолетовый светофильтр).

Экстинкция должна быть меньше 0,08; если экстинкция больше 0,08, необходимо удалить свободный       n-нитрофенол. Для этого реактив экстрагируют 2 или 3 раза равными объемами бутилового спирта и один раз — эфиром. Затем удаляют следы эфира выдерживанием на воздухе. Бутиловый спирт и эфир должны иметь нейтральную реакцию. Если реактив не выдерживает указанный выше тест, то экстрагирование повторяют.

Хранят раствор в холодильнике в замороженном состоянии в течение 2—3 недель.

4. Аминоуксусная кислота (гликокол, глицин).

5. Магния хлорид 6-водный.

6. Натр едкий; растворы 0,1 моль/литр, 0,02 моль/литр, не содержащие углекислого газа.

7. Буферный раствор — 0,05 моль/литр  глициновый буфер с добавлением катализатора хлорида магния — 95 миллиграмм/литр: 375 мг глицина и 10 мг MgCl2 х 6Н2О растворяют в 42 мл 0,1 моль/литр раствора едкого натра и доводят объем водой до 100 мл.

8. Субстратно-буферный раствор готовят смешиванием равных частей растворов 3 и 7, рН раствора 10,5. При смешивании 2 мл раствора с 10 милилитрами 0,02 моль/литр раствора едкого натра реактив не должен давать экстинкцию на фотоэлектроколориметре (ФЭКе) более 0,1 (толщина слоя — 1 сантиметр, длина волны — 400—420 нм). В противном случае раствор не годится или подлежит реэкстрагированию бутанолом или эфиром. После экстракции необходимо снова установить рН. Хранят в холодильнике в течение 2—3 дней.

9.  n-нитрофенол — калибровочный раствор 5 X 10-5 моль/литр: 696 миллиграмм n-нитрофенола растворяют в 0,02 моль/литр растворе едкого натра и доводят этим же раствором объем до 1 литра; 1 миллилитр раствора содержит 5 мкмолей n-нитрофенола.

Ход определения щелочной фосфатазы.

Опытная проба: в пробирки вносят по 1 миллилитру субстратно-буферного раствора, прогревают при температуре 37°С в течение 5 минут, затем добавляют по 0,1 миллилитру сыворотки. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют в течение 30 минут при температуре 37°С. После инкубации пробирки переносят в водяную баню со льдом, а затем добавляют по 10 миллилитров 0,02 моль/литр раствора едкого натра и тщательно перемешивают. Через 5 минут пробы измеряют на фотоэлектроколориметре (ФЭК) при длине волны 400—420 нм (фиолетовый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 1 сантиметр против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика

Из рабочего калибровочного раствора готовят ряд разведений, как указано в таблице, и измеряют оптическую плотность растворов при условиях, аналогичных опытным, против 0,02 моль/литр раствора едкого натра.

Исследование активности щелочной фосфатазы

 

№ пробирки	Рабочий калибровочный раствор (мл)	Содержание n-нитрофенола (мкмоль)	0,02 моль/л раствор NaOH (мл)	Активность ЩФ нмоль/(с∙л)
1	1	0,05	10,1	278
2	2	0,1	9,1	556
3	3	0,15	8,1	834
4	5	0,25	6,1	1390
5	7	0,35	4,1	1946

 

Исследование экскреторной функции печени.

 Об этой функции печени получают представление с помощью бромсульфалеиновой пробы. Последняя основана на внутривенном введении бромсульфалеина и учете времени его экскреции. Это имеет особенно большое значение для диагностики нежелтушных заболеваний печени.

Бромсульфалеиновая проба.

Относится к числу наиболее информативных и чувствительных методов исследования поглотительно-выделительной функции печени.

Ход определения. После одномоментного внутривенного введения 5% стерильного раствора бромсульфалеина из расчета 5 мг на 1 кг массы тела из вены другой руки берут кровь и определяют концентрацию красителя. В норме через 45 минут после введения красителя в крови остается не более 5% введенной дозы. Остальная часть бромсульфалеина захватывается клетками печени и выделяется в желчь. Проба считается положительной, если через 45 мин содержание красителя превышает 6-12% от первоначального уровня в крови, взятой через 3 минуты.

Применяют также модифицированную методику бромсульфалеиновой пробы, с длительным внутривенным введением красителя и анализом кривой очищения плазмы от бромсульфалеина. Скорость очищения хорошо отражает уровень плазмотока в печени, а также процессы поглощения и выделения красителя гепатоцитами.

Бромсульфалеиновая проба является одним из самых чувствительных методов оценки функции печени. Она становится положительной при любых поражениях паренхимы органа (острые и хронические гепатиты, жировой гепатоз, цирроз печени, доброкачественная гипербилирубинемия и др.) даже на самых ранних стадиях развития заболевания и хорошо коррелирует с тяжестью патологического процесса. Следует помнить, что проба бывает положительной также при внутрипеченочном холестазе и механической желтухе, что связано с нарушением оттока желчи, а также при застойной сердечной недостаточности.

Определение холинзстеразы. Холинэстераза синтезируется в гепатоцитах. Для суждения о функциональном состоянии печени большое значение имеет определение псевдохолинэстеразы. При поражении клеток печени активность холин-эстеразы падает, параллельно с этим снижается и уровень альбуминов.

Определение холинзстеразы.

Существует две разновидности холинэстеразы, которые различаются по типу субстрата, локализации в органах и тканях и биологической роли в организме. Холинэстераза (АХЭ) или ацетилхолин ацетилгидролаза (ЕС 3.1.1.7) содержится в эритроцитах, легких, селезенке и сером веществе мозга. Псевдохолинэстераза (ХЭ) полное название - ацилхолин ацилгидролаза (ЕС 3.1.1.8) содержится в сыворотке, печени, поджелудочной железе, сердце и белом веществе мозга. Определение сывороточной холинэстеразы (ХЭ) используется при диагностике заболеваний печени (гепатитов, циррозов, метастазов опухолей и др.). Во всех указанных случаях активность холинэстеразы снижается, такая же реакция наблюдается и при назначении сукцинилхолина или в случае интоксикации пестицидами.