Иммобилизденген фермент

Фермент иммобилизациясы үшін оның каталитикалық функциясында маңызы жоқ, функционалды топтардың қатысуы  принципиальды түрде маңызды. Сонымен гликопротеиндер тасымалдағышқа фермент молекуласының ақуызды емес, көмірсулы бөлігі арқылы қосылады.

Химиялық иммобилизациялаудың барлық әдістері фермент молекуласымен әректке түсетін тасымалдағыштың реакциялы тобының табиғатына байланысты жіктеледі. Төменде ферменттерді химиялық тәсілмен иммобилизациялаудың бірқатар мысалдары келтіріледі.

Гидроксотоптары бар тасымалдағышта ферметтерді иммобилизациялау. Фермент пен полисахаридті тасымалдағыш немесе синтетикалық диольды қосылыстың арасында ковалентті байланыс қалыптастырудың кең тараған тәсілі – бромцианды, ол 1967 жылы Р. Аксенмен, Дж. Поратпен және С. Эренбакпен ұсынылған. Тасымалдағышты бромцианмен өңдегенде реакцияға қабілетті цианаттар және имидакарбонаттар пайда болады, ол ферменттің нуклеофильді амино топтарымен әрекетескенде изомочевинаның және уретанның туындыларын ырады.

Аминотоптары бар тасымалдағышта ферменттерді иммобилизациялау. Ароматикалық сақинамен байланысқан тасымалдағыштың біріншілік аминотобы шамамен диазон тұзына айналдырады, сосын олар әртүрлі реакцияларға сәйкесінше әсер етеді. Бірігу (сочетание) реакцияларға фенольды, аминді, гуанинді, тиольді ақуыздар тобы қатысды. Сілтілі ортада тирозиннің фенолды радикалдары құрамында тасымалдағышпен байланысқан ақуыздары бар берік азоқосылыс түзеді. Сәйкесінше, п- аминофенилді функциялар әртүрлі тасымалдағыштарға оңай кіргізілуі мүмкін.

Активтелген карбоксиль топтарының туындыларына ие тасымалдағыштарда иммобилизациялау. Көпшілік жағдайда ақуыздың аминотоптарын тасымалдағыштардың ацилді топшаларымен қосу үшін ангидтерді, галогенгидридтерді, активтелген эфирлерді және карбон қышқылдарының басқа туындыларын қолданады.

Карбонды қышқылдардың реакционды қабілеті ферменттің аминотоптарының ацилирлеу реакциясында галогенгидридтерден эфирлерге дейін азаяды.

Сульфигидрилді топтарға ие тасымалдағыштарда иммобилизациялау. Тасымалдағыштың сульфигидильді топтары және ферменттері ауа оттегінің әсерінен дисульфитті байланыстарды қалыптастырып оңай тотығады.

Биокатализаторды тасымалдағышқа химиялық қосу жолымен иммобилизациялау жоғары ұтымдылығымен байланыс беріктігімен ерекшеленеді. Осыған қарамастан ферментті ковалентті иммобилизациялау тәсілі әлі өндірісте қолданысқа күрделілігіне және қымбаттығына байланысы аз. Бірақ та олар ғылыми және зертханалық зерттеулер өткізуде басқарылатын қажеті бар энзимдер жасауда теңдесі жоқ.

Иммобилизацияланған ферменттер және клеткалар  қолданылатын өндірістік процестер. Энзимдердің керемет каталитикалық қасиеттерімен гетерогенді катализатор ретіндегі иммобилизацияланған ферменттердің артықшылығының сәйкестігі жаңа өндірістік технологиялық процестерді жасауға мүмкіндік берді. Бұлардың барлығы азық-түлік және дәрілік препараттар өндіруге қатысты екендігін атап өту керек.

Қазіргі уақытта әлемде иммобилизденген ферменттерді және клеткаларды қолданатын немесе үлкен көлемде өндірістер ойластырылған:

1.Глюкозафруктоза сиропты алу.

2.Олардың раценмитикалық қоспасынан  оптикалық активті α-аминқышқылынан  алу.

3. Аммоний фумаратынан L- аспарагин қышқылын синтездеу .

 

 

1.4 Иммобилизденген биокатализаторлар  негізіндегі биотехнологиялық өндірістер

 

 

Иммобилизденген биокатализатор өндірістегі шикізаттарға қойылатын талаптар. Кез-елген  өндіріс өнімінің бағасы клеткалардың өсу процесіне пайдаланатын шикізаттың шығын деңгеіне қарай анықталады. Микробиологиялық өндірісте әр түрлі қосылыстарды алу үшін целлюлоза және крахмал құрамды шикізаттың гидролизаттары , ірі тоннажды өнеркәсіп және ауылшаруашылық қалдықтары : мелассаларды, целлюлозды-қағаз өндірісінің қалдықтарының қышқылды және ферментативті гидролизаттары, сүт сарысулары және т.б. пайдаланады. Микроорганизмдер дақылдарының өсу процесінде микроб синтезі мен трансформация өнімін алу үшін және клеткалардың өсуінің жоғары жылдамдығын қамтамасыз ету үшін  барлық қоректік компоненттегі дақылдану ортасын жақсарту керек. Ал енді биомассаны күнделікті өсіру қажет емес деп қарастырайық, себебі нақты өндірістегі бос клеткаларды иммобилизденген клеткаға ауыстырған кезде мұндай биокатализаторлардың артықшылығы ұзақ уақыт пайдалану мүмкіндігі болып табылады. Сондықтан ең алдымен клеткалар өндірісте қолданылатын утилицацизлау қабілеттігін тексеру керек.[5].

Шикі затқа қолданылатын талаптар: 1- арзан болу керек, 2- толық құнды болу керек , құрамында микроорганизмдердің қажетті барлық компоненттер болуы тиіс, 3- адам және микроорганизмдердің клеткасында зиянды улы заттар болдырмау керек, 4- қандайда бір өндірістің қалдығы болуы крек, 5- технологиялығы, 6- жылу немесе басқа өңдеулер өткізу кезінде қасиеттерін жоғалтпау керек.

Микробты өнімдердің түзілуіне әртүрлі факторлардың әсері. Сыртқы орта факторларының ферментация кезінде өнімдердің түзілуіне әсерін өнімдердің максималді концентрациясы арқылы көсетуге болады. Алайда, соңғы нәтиже келесі тәуелсіз параметрлер арқылы алдын- ала анықталады:

1. биомасса концентрациясымен ,
2. өнімнің түзілуінің меншікті жылдамдығымен,
3. субстраттану өнімінің түзілуімен ( шығымымен),
4. синтетикалық белсенділік мерзімінің ұзақтығымен,
5. өнімнің ыдырау жылдамдығымен.

Осы бес параметрді ескере отырып опимизацияны жүргізеді. Сонымен бірге дақылдардың өсуін сипаттайтын параметрді де қарастыру керек.

Мезімді дақылдар клеткалар биомассасының өсуі үшін келесі жағдайлар қажет:

а) тіршілікке қажетті егу материалы,

б) қоректік ортада энергия көзінің болуы қажет,

в) биомасса синтезіне қажет компонентердің болуы қажет,

г) қоректік ортада клеткалардың өсуін тежегішітердің болмауы,

д) ортада қажетті физико-химиялық жағдайладың сақталуы.

Егер барлық осы талаптар қанағаттандырылса, онда шексіз аз уақыт dt аралығында биомасса мөлшерінің жоғарлауы  dt биомасса мөлшері x пен уақыт интервалынаdt пропрцианалды болуы крек, яғни

dx = µxdt немесе dx/dt = µx.

dx/dt қатынасы клеткалар популяциясының  өсу жылдамдығын көрсетеді.Биомассаның  бірлігінің өсу жылдамдығын белгілейтін  µ параметрі, Өсудің меншікті  жылдамдығы деп аталады және  кері уақыт бірлігімен өлшенеді.

Өсудің тоқтап (немесе баяулап) өнімнің түзілуінің негізгі себептері: өсу ортасында қоректік компоненттердің азаюы, тежеуші өнімнің жинақталуы, биомассаның максималды тығыздыққа жетуі.

 

 

   1.5 Иммобилизденген  ферменттердің  артықшылықтары 

 

 

    Ферменттерді    биологиялық  катализаторлар   ретінде  өндірістің   әр  түрлі  салаларында – фармацевтикада,  ауыл  шаруашылығында,  тоқыма  өндірісінде,  медицинада, анализде,  органикалық  синтезде  және  т.б.  пайдаланылады. Соңғы  уақытқа  дейін  ферменттердің  кең  технологиялық   қолданылуы  бірқатар  себептермен   тоқталып  тұрды,  олардың  ішіндегі  маңыздылары;

a) ферменттерді  бастапқы  реагенттерден   және  процестің  аяқталуынан  кейін  реакция    өнімдерінен  бөліп  алу  қиындығы,  нәтижесінде   ферменттер  бір рет  қана  пайдаланылады,

 б) сақтау  және  әр  түрлі  әсерлер ( негізінен  жылулық)  кезінде  ферменттердің  тұрақсыздығы  ( лабилділігі ),

 в)  ферменттерді  таза  және  белсенді  күйінде  алу  қиындығы,  соған  байланысты  белсенді  ферменттердің  бағасы  қымбат  болады.

 Жаңа  биокатализаторларды  - иммобилизденген,  яғни  байланысқан  ферменттерді  құру  қолданбалы   энзимология   алдында  жаңа  мүмкіндіктерді  ашты. 

   Immobilize  ( ағылшын  тілінен)- таңып  тастау,  орнықтыру,  қозғалысын  шектеу,  байланысқан( орысша-делать  неподвижным,  лишать  подвижности,  сковывать, связывать)  мағынаны  білдіреді.

Бекітілген  ферменттерді   қолдану  бұрыннан  белгілі. 1916  жылы  Дж.Нельсон   мен  Е.Гриффин  көмірде   иммобилизденген  инвертаза  каталитикалық  белсенділігін  сақтайтынын  көрсеткен.  Иммобилизденген   ферменттерді  қолдануға   алғашқы  патент  1939 жылы   Дж.  Пранмюллер  мен  Г. Шлейкке   берілген,    олар  теріні   өңдеу  үшін   ағаш   ұнтақтарында  адсорбцияланған   протеолитикалық  ферменттерді  қолдануды  ұсынған. 1953  жылы  Н.Грубхофер  мен  Д.  Шлейт  алғаш  рет   ферменттерді  иммобилиздеуге  жаңа  әдіс   қолданған -  ковалентті  байланыс.  Сол  кезден  бері  ферменттер   негізінде  гетерогенді  катализаторлардың   өңдеуі   жүргізілуде.  1971жылы   Хенникерде  инжинерлі  энзимология  бойынша  бірінші   конференцияда   «иммобилизденген   ферменттер»  термині   рәсімделген.[6].

   Көптеген  жұмыстарда   көрсетілгендей,   сәйкес   тасымалдаушылар   мен   иммобилиздеу   тәсілдерін  таңдау  кезінде  ферменттердің  арнайлығы   PH-пен   темперетураға  тәулділігі,  сонымен  бірге  денатурлеуші  әсерлер   кезінде   ферменттің    тұрақтылығы  сияқты   қасиеттерін   өзгертуге  болатындығы   көрсетілген. Сонымен  қатар  иммобилизденген  ферменттерді   технологияда  пайдалануға  қолайлы,  бұл  осындай   гетерогенді   катализаторлармен  процесті  үздіксіз   жүргізу   және   атализденетін  реакциялар  жылдамдығы   мен  өнімнің  шығуын  реттеу  мүмкіндіктерімен   анықталады.

 

 

   1.6 Негізгі шикізат – мелассаның құрамы

 

 

   Химиялық құрамы жағынан меласса сахароза мен бейсахарозаның концентрленген ерітіндісі болып табылады. Мұнсыз ары қарай қантты қанттықызылша өндірісінен кәдімгі технологиямен бөліп алуға болмайды.

   Заводтан алынатын мелассаның құрамы келесідей (массаға %) :

              Құрғақ заттар                   82,0

              Сахароза                            48,4

              Бейсахара                           33,6

               Су                                      18,0

   Меласса бағалы өнім болып  есептеледі, сондықтан халықшаруашылығында  кеңінен қолданылады. Айтар болсақ, нан ашытқы өндірісінде мелассаның 14% , спирт өндірісінде,ерітінділер  мен тағам өндірістерінде 62%, мал  шаруашылығында 22%, т.б. 3%  қолданылады.

   Ашытқы заводтарына меласса  бірдей құрамында әкелінбейді. Сондықтан  ашытқы өндірісінде олардың құрамындағы  аммоний азотын анықтау маңызды.

 Меласса құрамындағы аммоний  азоты 0,4% болған жағдайда ашытқылар  тез жиналып, жоғары сапаға ие  болады.

   Толық құрамды мелассада қанттың құрамыжоғары болады(48 – 50% ) және микроорганизмдер көбеймейді. Мелассаны сумен араластырғанда микроорганизмдердің көбеюі үшін қолайлы жағдай жасалынады.

   Кей жағдайда мелассада  ашытқы саңырауқұлақтары торулопсис, кандида, зең саңырауқұлақтары аспергилиус, пеницилум, және мукорды да табады.

   Меласса құрамы қанттау  кезінде өзгереді. Мезгіл басында  алынатын меласса ашытқы өндірісіндегі  қажжеттіліктерді қанағаттандырады, яғни құрғақ заттар, жалпы және  аммоний азоттары, калий, калций, магний және микробиологиялық құрамдары бойынша.

   Мезгіл соңында алынған  мелассаның құрамында бір қатар  кемшіліктер болады, яғни азот, аммоний  азотының кем болуы мен кальций  құрамының жоғары болуы және  микроорганизм санының тым көп  – 15 мың болуы байқалады.

   Мелассаның бұлай өзгеруі  технологиялық процестің өзгеруімен  сипатталады,яғни қант алу технологиясында  мұздату мен қызылшаны еріту  кезінде жүреді.

   Нан ашытқысын алу үшін  мелассаның құрамы келесідей  болуы қажет(% бойынша):

 

  Құрғақ заттар концентрациясы                                                          75 кем емес

  Тік поляризация бойынша  қант құрамы                                            46 – 50

  Инвертті қант                                                                                       2 кем емес

  Сапалылығы                                                                                         55 – 65

   Меласса реакциясы, рН                                                                      6,5 – 8,5

   Жалпы азот                                                                                        1,4 кем емес

   Аммоний азоты                                                                                    3

   Зола                                                                                                       7,0

   Кальций                                                                               1,0 жоғары  емес                          

   Магний                                                                                             0,15 кем емес