Иммобилизденген фермент

       - полипептидтік  тізбегі үзілу нәтижесінде және  ферменттердің функционалды топтарының  тотығуы нәтижесінде дисульфидтік  байланыстардың ыдырауы, фосфорилдену, дезаминдену т.б. модификциялар нәтижесінде  бірінші реттік құрылымның өзгеруі;

       - детергенттер, зәр  қышқылы (мочевина), температура және  т.б. әсерінен олигомерлі белок-ферменттердің  суббөліктерге диссоциациялануы.

   Иммобилизденген ферменттердің  жоғары тұрақтылығы, олардың қозғалғыштықтардың  төмендеуі немесе басып тастау  салдарынан болады, осының нәтижесінде агрегация процестері және фермент молекуларының диссоциациялануы жүреді, сондай-ақ стерикалық кедергілердің пайда болуының нәтижесінде протеазалар ферменттің микроқоршауына ене алмайды және протеолизді жүргізе алмайды.

  Ферменттерді тасымалдаушылардың «тығыз» саңылауына бифункционалды агенттікпен ішкі молекулалық енгізу және т.б. ферменттерді мақсатты түрде тұрақтандыру үшін ферменттің нативті конформациясын бекітуді жүргізеді.

   Иммобилизденген ферменттердің  ингиберленуі және активтелуі.

   Нативті ферменттердің белсенділігін  сипаттау үшін ерітіндіде const Vinax және Km-ді (Михаэлис константасы) пайдаланады. Микроқоршаудың қасиеттерінің вариациясы  салдарынан иммобилизация осы  параметрлердің өзгеруін туғызады. Мысалы, фермент молекулалары еріткіштің араласпайтын қабатымен (Нернст қабатымен) қоршалады. Ол қабатта ерітіндінің негізгі массасына қарағанда субстраттың концентрациясы аз болады, иммобилизденген ферменттерді қанықтыру үшін субстраттың концентрациясы жоғары болуы керек. Km мөлшеріне егер субстрат зарядталған болса тасымалдаушының иондық табиғаты әсер етеді. Иммобилиздеу кезінде Km-ның төмендеуі қосымша практикада артықшылықтарды береді, өйткені бос фермент жағдайымен салыстырғанда субстраттың аз концентрациясында реакция жылдамдығы жоғары болады. Km – ның жоғары болыу керісінше, реакцияның берілген жылдамдығына жету үшін бос ферментке қарағанда субстраттың көп концентрациясы керек.

   Иммобилизденген және бос  ферменттердің белсенділігіне төмен  және жоғары молекулалы заттар, субстраттар және реакция өнімдері әсер етеді.

   Төмен молекулалы заттар  өзінің ферментке әсер еткен  кезінде полимерлік матрицамен  негізделген тарату және диффузиялық  кедергілер әсеріне ұшырайды.

   Жоғары молекулалы қосылыстар  кеңістіктің қиыншылықтарына байланысты энзиммен әркезде байланыса алмайды.

           

 

   1.2 Микроб клеткаларының физиологиялық – биохимиялық белсенділігіне иммобилиздеудің әсері

 

 

Иммобилизденген жағдайдағы клеткалардың күйін сипаттау үшін бірқатар терминдер қолданылады:

1. «Тіршілік етуге қабілетті» (viable) иммобилизденген клеткалар –  ұрпақ беруге қабілетті. Тікелей  тасымалдаушы ішінде (бетінде) бөліне  алатын немесе тасымалдаушыдан  бөлектенгеннен кейін көбейе  алатын иммобилизденген клеткалар  тіршілік етуге қабілетті деп есептеледі. Сәйкесінше ұрпаұ беру қабілеттігін «жоғарлатқан» клеткалар «тіршілік етуге қабілетсіз» деп аталады (non viable).[1].

2. «Өсуші» (growing) клеткалар – тек  иммобилизденген күйінде ғана  көбейе алатын клеткалар.

  3. «Өспейтін» ( non growing ) иммобилизденген клеткалар – иммобилизденген күйде бөлінбейтін, бірақ метаболиттік белсенді клеткалар.

Клетка ішілік заттардың жинақталуы есебінен өспейтін клеткалардың мөлшері мен салмағы  жоғарлауы мүмкін, бұл иммобилизденген биомассаның жалпы салмағының жоғарлауына әкеледі. «Тыныштықтағы» (resting cells) терминіне қарағанда «өспейтін» терминін қолданған дұрыс, себебі біріншісіне уақытша (арнайы жағдайларға байланысты) бөлінбейтін және метаболитті белсенді емес клеткалар жатады.

4. «Тірі» (living) және «өлі» (dead) клеткалар түсініктерін қолданбау ұсынылады, себебі егер клеткада жалғыз микрооганизм қызмет етсе де, мұндай клетканы өлі деп аталуы мүмкіндігі – философиялық сұрақ болуы мүмкін.

Метаболитикалық белсенділік – клеткалардың метаболизмінің негізгі белсенділігі «көмірсулардың катаболизмі».

Синтетикалық белсенділік – иммобилизденген клеткалардың соңғы өнімді Синтездеу және секрециялау қабілеттілігі. Клеткалардың секторлы қабілетін айта кету маңызды, себебі әр түрлі қосылыстарды синтездеп, клетка ішінде жинақтайтын клеткаларды иммобилизденген күйінде қолданудың қажеті жоқ.

Иммобилизденген клеткалар негізіндегі технологиялардың дамуы клеткалардың иммобилизденген күйдегі физиологиясына байланысты көптеген жаңа, қызықты, бірақ аса қиын мәселелерді тудырады.[2].

Қазіргі кезде бос дақылданған микроорганизмдермен салыстырғанда, иммобилизденген клеткалардың тұрақтылығының жоғарылауы  жайлы мәліметтержинақталған. Иммобилизденген клеткалардың тұрақтылығы  клетканың белсенділігінің ұзақтығымен көрсетіледі, сонымен қатар рН пен температура оптимумдарының кеңеюі, қоршаған ортаның жағымсыз әсерлеріне байланысты жоғары тұрақтылығы байқалады. Бос клеткаларға қарағанда иммобилизденген клеткалардың өсімі өздерінің өнімдерінің жоғары концентрацияларында тежелетіні көрсетілген.

Escherichia coli-дің рекомбинантты клеткаларын  қолдануға қатысты жаңа мәліметтерде  β-галактозидаза өндіретін иммобилизденген  рекомбинантты клеткалардың жоғары  тұрақтылығы және плазмидалардың  көшірмелерінің қатысында иммобилизденген  клеткалардың тұрақтылығы көрсетілген.

Иммобилизденген клеткалардың морфологиясына, физиологиясына және метаболиттік белсенділігіне әсер ететін факторлар талданып, жүйеленген, дәл осы факторлар иммобилизденген клеткалардың (микроб, өсімдік және жануар) тұрақтылығын және басқа да сипаттамаларын анықтайды:

1. Қолданылатын клеткалардың метаболизмі, тығыздығы мен тасымалдаушыға  біркелкі орналасуы;

2.Тасымалдаушының қасиеттері (матрица  немесе беті);

3.Клетка айналасындағы микроқоршаудың  табиғаты;

4. Биокатализаторды қоршайтын ортаның қасиеттері.

Қорыта келгенде, иммобилизденген күйдегі клеткалардың физиологиясы мен метаболизмінің өзгеруі иммобилиздеу процесінің өзінен емес, яғни клетканың қозғалыссыз күйінен емес, ал оларды қоршаған ортаның физико-химиялық параметрлерінің өзгеруінен болып табылады.

 

 

   1.3 Ферменттерді иммобилизациялау тәсілдері

 

 

Иммобилизацияның принципиальды екі тәсілі бар: фермент және тасымалдағыш арасында ковалентті байланыс пайда болмайтыны (иммобилизацияның физикалық тәсілі) және олар арасында ковалентті байланыс пайда болатыны (иммобилизацияның химиялық тәсілі). Бұл әдістердің әрқайсысы түрлі тәсілдермен іске асады.

Ферменттерді иммобилизациялаудың физикалық әдісі. Ерімейтін тасығышта ферментті адсорбциялау арқылы көлденең тігілген гельдің саңылауларына энзимдерді қосу жолымен жартылай өткізгіш құрлымдарда немесе екіфазалы жүйелерде іске асады.

Ерімейтін тасымалдағыштарда ферменттер адсорбциясы. Адсорбционды иммобилизация кезінде ақуыздық молекула тасымалдағыш бетінде электростатикалық, гидрофобтық, дисперсиондық әрекеттесулер және сутектік байланыстар есебіне ұсталынып тұрады. Адсорбция ферментерді иммобилизациялаудың алғашқы тәсілі болды (Дж. Нельсон, Э. Гриффин, 1916), бірақта ол қазірде өз мәнін жоймады және де өндірісте иммобилизациялы фермент алудың кең қолданылатын тәсіліне айналды. Тасымалдағыштағы ақуыз молекуласы адсорбциясының тиімділігі жеке бетпен (сорбция центрлерінің тығыздығымен) және тасымалдағыш саңылаулылығымен анықталады. Ерімейтін тасымалдағыштарда ферменттерді адсорбциялау процесі аса қарапайымдылығымен ерекшеленеді және ферменттің сулы ерітіндісінің ферментпен әрекеттесуі (статистикалық әдіс, орын ауысуда, бағаналарды пайдалану арқылы динамикалық әдіс  ) нәтижесінде жүзеге асады. Осы мақсатта фермент ерітіндісін жаңа тұнбамен араластырады, мысалы, титан гидроксиді және қолайлы жағдайларда кептіреді. Иммобилизацияның мұндай нұсқасында практика жүзінде фермент активтілігі 100 пайызға сақталады, ал ақуыздың жекеленген концентрациясы 1г тасымалдағышта 64 мг жетеді.

Адсорбционды тәсілдің кемшілігіне жатқызуға болады ферменттің тасымалдағышпен байланысуының берік еместігі. Иммобилизация жағдайларының өзгеруінде ферменттің десорбциясы, оның шығындалуы және реакция өнімінің ластануы  өтуі мүмкін. Фермент пен тасымалдағыштың байланысу беріктігін жоғарлату оны модификациялау (металл иондарымен өңдеу, көпфункциональды агенттермен – полимерлермен , ақуыздармен, гидрофобты қосылыстармен, липид моноқабатымен және т.б ) арқылы мүмкін. Кейде керісінше, бастапқы фермент молекуласы модификацияға ұшырайды, бірақта ол кезде оның активтілігі төмендейді.

Гельге қосу жолымен ферменттерді иммобилизациялау. Полимер гельді үшөлшемді құрлымға енгізу тәсілімен ферменттерді иммобилизациялау өзінің қарапайымдылығымен және ерекшелігімен кең таралған. Тәсіл жеке ферменттерді иммобилизациялауға ғана емес, мультиэнзимді комплекстерді де және интактты жасушаларды да иммобилизациялауға қолданылады. Бірінші жағдайда, ферментті мономердің сулы ерітіндісіне енгізеді, кейін полимеризация өткізеді, нәтижесінде ұяшықтарында молекулярлы ферментпен полимерлі гельге қосылған кеңістікті құрлым пайда болады. Екінші жағдайда, ферменті дайын полимерлі ерітіндіге салады, оны нәтижесінде гель қалыптасқан жағдайға өткізеді. Бірінші нұсқада полиакриламидтің, поливинилді спитртің, поливинилпирролидоннің, силикагелдің гельдері қолданылады, ал екіншіде – крахмал, агар – агар, каррагинан, агароза, кальций фосфат гельдерін пайдаланады.

Гельде ферментті иммобилизациялау тасымалдағыш көлемінде энзимнің бірқалыпты бөлінуін қамтамасыз етеді. Көпшілік гельді матрицалар жоғары механикалық, химиялық, жылулық және биологиялық тұрақтылыққа ие және оның құрлымына енген ферментті көпқайтара қолдану мүмкіндігін қамтамасыз етеді. Алайда,  бұл тәсіл суда ерімейтін субстраттарда ферметтерді иммобилизациялауда жарамсыз болып табылады.

Жартылайөткізгіш құрлымдарда ферменттерді иммобилизациялау. Бұл тәсілмен иммобилизациялаудың мәнділігі мынада: ферменттің сулы ерітіндісін субстраттың сулы ерітіндісінен жартылайөткізгіш мембрана көмегімен бөлу, ол субстраттардың төменмолекулалы молекулаларын және кофакторларды өткізеді, бірақ ферменттің үлкен молекулаларын тұтып қалады. Бұл әдістің бірнеше модификациясы өңделген, қызықтыратыны микрокапсулдеу және липосомдарға ферментерді ендіру.[3].

Бірінші бұл тәсіл 1964 жылы Т. Чангпен ұсынылған және оның мәні ферменттің сулы ерітіндісі тұйықталған микрокапсуланың ішіне қосылады, оның қабырғалары жартылайөткізгіштерден қалыптасады. Мембрананың пайда болуының механизімінің бірі ферменттің сулы бетінің микрокапсуласында екі қосылыстың фазааралық поликонденсациясы оның бірі суда еріген, ал келесісі органикалық фазада оған мысал ретінде помконденсация жолымен фазалардың бөліну бетінде гексаметиллендиамина 1.6 (сулы фаза) және себацион қышқылының голгенангидриді (органикалық фаза) микро капсуланың түзілуі   

 Алынатын капсулалардың көлемі  он және жүз  микрометр, ал мембрана  қалыңдығы- микрометрдің жүзден  бірі.

Микрокапсулдеу әдісінің артықшылығы- қарапайымдылық универсалдылық нативті  ферменті көп қайтара қолдану мүмкіндігі (фермент прорегирлемейтін субс траттан және реакция өнімдерінен қарапайым фильтрлеу жоымен інуі мүмкін ). Микрокапсульдеу әдісі арқылы жеке ферменттер ғана емес, және мультиэнизмді комплекстер, толық клеткалар және клеткалардың жеке фрагменттерін иммобилизациялауға болады. Жоғары молекулалы субстраттарды капсулденген ферменттерге айналдыра алмауын әдістің кемшілігіне жатқызуға болады.

Иммобилизациялаудың инкапсудеу әдісіне жақыны болып ферменттердің ерітінділерін липасомдарға қосу есептеледі. Ол липидтердің сферикалық  немесе ламерлярлы жүйелерінің қос қабаты. Бұл тәсіл алғаш рет 1970 жылы  Дж. Вайсманмен және Дж. Сэспен ферменттерді иммобилизациялау үшін қоданылды. Липид ерітіндісінен липасома алу үшін (жиірек лецитин) органикалық еріткіште булайды. Құрамында ферменті бар липидтердің жұқа қабықшасын сулы ерітіндіде диспергирлейді. Диспергирлеу процесінде липосоманың биқабаты липидті құрлымдарының өздігінен жиналуы өтеді, оның құрамында қосылған фермент ерітіндісі бар.

Липосом құрамына қосу жолымен иммобилизденген ферменттерді көбіне медициналық және ғылыми мақсатта қолданады не ферменттердің айтарлықтай бөлігі биологиялық мембраналарда липидті матрикс құрамында клеткада жиналған, сондықтан липосомдарды зерттеу клеткадағы тіршілік процесінің заңдылықтарын зерттеуде маңызы зор.

Ферменттерді иммобилизациялаудың химиялық әдісі. Фермент және тасымалдағыш арасында жаңа ковалентті байланыс қалыптастыру жолымен ферменттерді иммобилизациялау әдісі - өндірістік биокатализаторлар алудың кең тараған тәсілі.

Физикалық әдістен айырмашылығы иммобилизациялаудың бұл тәсілі ферментпен тасымалдағыш арасында берік және қайтымсыз байланысты қамтамасыз етеді және көпшілігінде энзим молекуласын трақтандырумен сипатталады. Бірақта ферменттің тасмалдағыштан салыстырмалы бір ковалентті байланыстан қашықта болса, каталитикалық процессті іске асыруда қиындық тудырады. Ферментті тасымалдағыштан қою (вставка) көмегімен бөледі (спейсер) көбіне оның роліне бифункциональды және көпфункционалды агенттерді (бромциан, гидразин, сульфурилхлорид, глутарлыдиальдегид және т.б) алынады. Мысалы, тасымалдағыштың микроқоршауынан галактозил трансферазаны шығару үшін фермент және тасымалдағыш арасына        -СН2 - NH – (СН2)5 – СО – реттілікті қояды. Бұл жағдайда иммобилизденген фермент өз құрамына өзара коваленті байланыс арқылы байланысқан тасымалдағышты қойғышты (вставка) және ферментті қосады.