Жалпы медициналық микробиология пәнінің зертханалық сабақтарына арналған оқу-әдістемелік құралы

материалды жағып шығады. Себіндіні инкубациялаған соң бактериялардың біркелкі жаппай өсуі байқалады.

   Б і р і г і п   к е т к е н   ө с  у л е р   а л у. Шыны  түткішедегі қиғаш агарлы қоректік ортаның төменгі бөлігінің конденсатына дейін себу материалы бар құрықты апарып, айқыш-ұйқыш қозғалыспен сыртқа қарай агардың қиғаш беткейімен таратып шығады. Құрықты шығарып, түтікше бетін отқа бір қақтап алып, оны тығынмен жабады. Құрықты от жалынында стерильдеп, штативке қояды.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Схема 3.1.  Таза дақылды бөліп алу және идентификациялау

 

Зерттелетін  материал

 

 

Жағындыларды немесе нативті препараттарды микроскоппен көру

 

І кезең

Тығыз элективті және дифференциалды диагностикалық орталарға себу

Оқшауланған колонияларды алу үшін Петри табақшасындағы тығыз ортаға себу

Молайту сұйық орталарына себу (қажеттілігіне қарай)

 

Дақылдық қасиеттерін пайымдау: өсу сипаты

Оқшауланған колониялар                                     сипаттамасы

                                                                             

ІІ кезең                                                         

 

Бактериялардың морфологиялық және тинкториялық қасиеттерін пайымдау: жағынды – Грам әдісімен және/немесе басқа әдсіпен бояу

Дақылдық қасиеттерін пайымдау: колониясы- ның  морфологиясы

 

 

 

                                                                                                            

Оқшауланған колониядан қиғаш агарға немесе басқа орталарға себу (таза дақыл алу үшін)

ІІІ кезең

Таза дақылдың біртектілігін бағалау: жағынды - Грам әдісімен және/ немесе басқа әдсіпен бояу

Таза дақылдың идентификациясы

 

Морфологиялық және тинкториялық қасиеттері бойынша

Дақылдық қасиеттері  бойынша

Биохмиялық белгілері бойынша:  "ала " қатар орталарына себу

Антигенді белгілері бойынша: серологиялық идентификациясы мен серотиптеуі

Түрлік және/немесе типтік бактериофагтарға сезімталдылығы бойынша

Вируленттік факторларды өндіруі бойынша

Өзіне тән органикалық молекулалардың болуы бойынша: идентификацияның молекулярлы-биологиялық белгілері бойынша

 

ҚОРЫТЫНДЫ : БАКТЕРИЯНЫҢ ТҮРІН АНЫҚТАУ

     

Шыны түтікшемен және бактериялық құрықпен стерильді жұмыс істеу техникасы  2.1 тақырыпта көрсетілген.

    

 Бактериялардың таза  дақылын бөліп алу. 

       І  э т а  п ы  –  з е р т т е  у   м а т е р и а  л ы н а н   о қ ш  а у л а н ғ а н    к о л о -    н и я  л а р    а л у.  Зерттелу  материалынан бактериялардың таза  дақылын бөліп алу кезінде ең алдымен материалдағы бактерияның концентрациясына зейін  қою керек. І ші кезеңінде бактерияның морфологиялық және тинкториялық қасеттері бойынша бастапқы идентификациясы жүргізіледі. Бұл мәселені шешу үшін зерттеу материалынан бекіндірілген жағынды дайындап, оны Грам әдісімен (немесе зерттеу мақсатына байланысты басқа да әдістермен) бояп, микроскоптайды. Егер көру аймағында бактериялар мөлшері жоғары болса, онда зерттелуші материалды натрий хлоридінің стерильді изотоникалық ерітіндісі бар шыны түтікшеде сұйылтамыз. Препараттағы бактериялар аз мөлшерде болса, бактерияның концентрациясын жоғарылату мақсатында үлгінің бүкіл көлемін сұйық молайту ортасына себеді. Бактерияның қандайда бір түрін бөліп алу қажет болса, себуді элективті ортаға жүргізеді.

     Бактериялардың таза  дақылын бөліп алу үшін алдымен  зерттеу материалындағы әр түрге  жататын микробтарды қоректік  ортаның беткейіне жайып алу  қажет. Әдетте, бұл үшін зерттеу  материалын тығыз қоректік орта  беткейіне оқшауланған колониялар  алатындай етіп себу қажет (жоғарыдан қара). Себу аяқталған соң табақшаны түбін жоғарыға келтіріп аударып қояды да қаламмен белгі жазып, 18-24 сағатқа 37°С-тағы термостатқа орналастырады.

      Кейде пластинкалық  ажырату әдісі де қолданылады. Онда зерттеу материалының әртүрлі сұйылтпаларын колбада немесе шыны түтікше балқытылып, 50°С-қа суытылған қоректік агармен араластырады. Ол  агарды Петри табақшаларына құйып, термостатта инкубациялайды.

      Физикалық және химиялық факторларды қолдана отырып, бактерияларды бір-бірінен айыру.  Споратүзуші бактерияларды бөліп алу үшін зерттеу материалын 20 минут бойы 80°С-та қыздыра немесе азғана уақыт қайната отырып, ондағы спора түзбейтін бактерияларды жойып аламыз. Сонда, спора түзуші бактериялар өміршеңдігін сақтайды да себу жасағанда қоректік орта беткейіне өсіп-өне бастайды. Егер материалда спора түзуші бактерияның бір ғана түрі болған болса, онда осылайша таза дақыл алуға болады. Ал, егер, материалда бірнеше түрлі споратүзуші бактерия болған болса, онда таза дақылды бөліп алу әрі қарай стандартты әдістермен жүргізіледі.

       Психрофильді  бактериялардың таза дақылын  бөліп алу кезінде материалдағы  бөгде микрофлораның өсуін тежеу  үшін оны төменгі температурада  инкубациялаймыз. Мысалы, оба қоздырғышының (Yersinia pestis) таза дақылын алу үшін себіндіні 5°С шамасындағы термостатта инкубациялайды.

      Бірқатар жағдайларда  бактериялардың таза дақылын  бөліп алу үшін, зерттеу материалына  сол  түр тұрақты болып келетін  факторларымен әсер ете отырып, ондағы басқа түрлі бактерияларды жою әрекетін жасайды.  Осы мақсатта антимикробты препараттар, химиялық заттар және бактериофагтар қолданады. Олардың нақты конценртациясын қоректік ортаға енгізеді де оған зерттелуіші материалды себеді. Осылайша бір текті бактериялар өсіп шығады.

      Жоғарыда айтылғандардан бөлек бактериологиялық практикада басқа да әдістер қолданылады. Мысалы, Proteus туысы бактерияларының (Proteus bulgaris) таза дақылын алу үшін, олардың "жер бауырлап" өсу қабілетін қолданады (Шукевич әдісі). Мұнда қиғаш агар қойнауына егілген бактерия дақылдану уақыты аралығында агардың бүкіл беткейіне тарап өседі.

      І І  э т а  п  -  ә р і   қ а р  а й   и д е н т и  ф и к а ц и я л а  у   ү ш і н    т  а з а   д а қ ы л  д ы   ж и н а қ т  а у. ІІ кезең материалдың бастапқы  себіндісінің нәтижесін бағалаудан және өскен бактерияның дақылдық белгілерін – олардың қоректік орталарда өсу ерекшеліктерін пайымдаудан бастайды.

      Микробтық колониялардың  морфологиясы едәуір ақпаратты  дақылдық белгілер болып табылады. Колониялар өлшемі, пішіні, түсі, қоюлығы, жиектерінің контуры, құрылымы мен беткейлік сипаты бойынша ажыратылады (сурет 3.1.1). Колониялар өлшемі бойынша ірі (диаметрі 4-5 мм-ден жоғары), орташа (2-4 мм) және майда (1-2 мм), пішіні бойынша дөңгелек, жапырақ тәрізді, шашақ тәрізді т.б. болып келеді. Колонияның түсі белгілі бір пигменттің өндірілуіне байланысты ақ, сары, қызыл т.б. болады. Қоюлық дәрежесі бойынша құрғақ, ылғалды, шырынды немесе кілегейлі колониялар болады. Колониялардың беткейі тегіс, әжімделген, сызылған, жалпақ, дөңес, езілген болып келеді. Жиегі бойынша тегіс, толқынды, тарамдалған, ішкі құрылымы бойынша аморфты, түйіршікті, талшықты колониялар болады.

      Микробтық газон  алу кезінде бактериялардың өсу  сипаты құрғақ, ылғалды, "баурлап  қозғалушы", қатпарлы, пигменттелген болуы мүмкін. Шыны түтікшелердегі сұйық орталарда бір бактериялар диффузды лайсаңдану түзе өссе, енді бірі түбіне немесе қабырғасына орныға өсседі; кейбір бактериялар орта беткейінде қабықша түзсе, енді бірі түбінде тұнба түзеді. Және де бұлардың әрқайсысының сипаты да әртүрлі болады. Мысалы, оба қоздырғышы орта беткеінде қабықша түзгенде одан төмен қарай жіпше тәрізді өсінділер ілініп тұрады, түбіркүлез қоздырғышы қалың қабықша түзеді. Тұнбалар да борпылдақ, тығыз т.б. болуы мүмкін. Осының барлығы әрбір бактерияның физиологиялық ерекшеліктерімен түсіндіріледі.

     Зерттеу материалының  алғашқы себіндісін бағалау үшін  табақшаларда өскен колонияларды  қарап, олардың морфологиясын пайымдайды. Бактериялардың морфологиясы мен  тинкториялық қасиеттерін анықтау үшін әртүрлі типтегі колониялардан жағынды дайындайды да Грам әдісімен бояп, микроскоптайды. Туыстас бактериялардың колониялары морфологиясы жағынан ұқсас немесе өзгеше болуы мүмкін екендігін есте сақтау керек. Әрбір типтегі оқшауланған колониялардан материалдар алып, әрқайсысын шыны түтікшелердегі қиғаш агарларға немесе қандайда бір басқа қоректік орталарға ауыстыра себеді. Ол үшін колонияның бір бөлігін (көрші жетқан колонияларға тиіп кетпей) құрықпен алып қиғаш агар беткейіне штрихпен себеміз. Таза дақылды бөліп алып жинақтау үшін зерттеу материалында болған бактериялардың колонияларын ғана таңдаймыз. Басқа бактериялардың колонияларының пайда болуы жұмыстың стерильді жағдайы жеткілікті түрде қатаң сақталмау салдарынан басқа микробтармен контаминациялануы (ластануы) нәтижесімен аяқталуы мүмкін.

      Анаэрорбты бактерияларды дақылдау ерекшеліктері. Қатаң анаэробтармен жүргізілетін барлық іс-шаралар оттегісіз жағдайда жүргізіледі. Ол үшін ортаның икемделуші газды құрамы бар, үстелүстілік нықталған камера қолданылады. Себулерді анаэробтарға арналған арнайы молайту (элективті) орталарына (Китто-Тароцци, тиогликоль) жасайды. Себінділерді арнайы СО2 – инкубаторларында немесе анаэростаттарда (қажетті құрамда газды қоспамен толтыруға арналған түтікшемен қамтамасыз етілген нықтала жабылатын қақпағы бар металдық немесе пластмассалық контейнерлерде) инкубациялайды. Көлемі жағынан аздау себінділерді ( 1-2 Петри табақшалары) инкубациялау үшін бірнеше минут ішінде ауалы ортадан оттегінің толығымен шығып кетуін қамтамасыз ететін газды қоспалардың химиялық генераторы бар пластикалық пакеттер қолданады.

 

 

Тақырып 3.2. БАКТЕРИЯЛАРДЫҢ ИДЕНТИФИКАЦИЯСЫ

 

      Кіріспе. Идентификация – микробтың түрлік тегін анықтау (қою). Қазіргі уақытта жалпылай қолдау тапқан идентификация әдісі зерттелуші материалдың едәуір маңызды фенотиптік белгілерінің айқын жиынтықтарын пайымдауға негізделген.  Идентификация үшін критерийлер микробта сол түрге тән негізгі нышандардың жиынтығы (таксономиялық белгілер) бар болуы болып табылады. Түрді бекіту бактериялардың халықаралық таксономиясымен (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology) келісіле жүргізіледі.

     Бактериялардың негізгі түрлік нышандарына мыналар жатады:

▪ микробты жасушаның морфологиясы;

▪ тинкториялық қасиеттері – қарапайым және күрделі бояу әдістерімен боялу ерекшеліктері;

▪ дақылдық белгілері – микробтың қоректік ортада өсу ерекшеліктері;

▪ биохимиялық белгілері бактерияда әртүрлі химиялық қосылыстарды синтездеуге немесе ыдыратуға (ферментациялауға) қажетті ферменттердің  болуы;

     Бактериологиялық тәжірибеде  көбінесе қантеріткіштік және  ақуызеріткіштік ферменттерді пайымдайды.

     Идентификация кезінде  қолданатын қосымша белгілерге мыналар жатады;

▪ түрспецификалық антигендердің болуы (10 шы тарауды қара);

▪ түрспецификалық бактериофагтарға сезімталдылығы (5 ші тарауды қара);

▪ белгілі-бір антимикробты препараттарға түрлік резистенттілігі;

▪ патогенді бактериялар үшін – вируленттіліктің белгілі-бір факторларын өндіру.

      Биоварға дейінгі  ұсақ түрлік идентификация (серовар, фаговар, ферментовар т.б.) – типтеу – мынадай сәйкес маркерлерді айқындауға негізделген: антигенді (серотиптеу, 10-шы таруды қара), типтік бактериофагқа сезімталдылығын (фаготиптеу, 5-ші тарауды қара) және т.б.

      Соңғы жылдары  идентификацияның жетілген биохимиялық және молекулярлы-биологиялық әдістері өңделіп, қолдана басталуда: хемоидентификация, нуклеин қышқылдарының талдамасы: рестрикциялық талдама, гибридизация, полимеразды тізбектік реакция (ПТР), риботиптеу және т.б.

▲ Әдістемелік нұсқаулар

     Биохимиялық идентификация. Бактериялардың биохимиялық белсенділігін

бағалау үшін мынадай реакциялар қолданылады:

1. ферментация – субстраттың  аралық өнімге дейін жартылай  ыдырауы, мысалы көмірсулардың органикалық  қышқылдар түзе ферментациялануы;

2. тотығу – органикалық субстраттың СО2  және Н2О дейін толық ыдырауы;

3. ассимиляцияны (утилизация) – көміртегінің  немесе азоттың көзі ретінде  өсу үшін субстратты қолдану;