Жалпы медициналық микробиология пәнінің зертханалық сабақтарына арналған оқу-әдістемелік құралы

4. субстраттың диссемиляциясы (деградациясы);

5. субстраттың гидрозизі.

     Микобтарды биохимиялық белгілері бойынша идентификациялаудың классикалық (дәстүрлік) әдісі, - таза дақылды белгілі-бір субстраты бар дифференциалды-диагностикалық орталарға микроорганизмнің сол субстратты ассимиляциялау қабілетін бағалау немесе оның метаболизмінің соңғы өнімдерін анықтау мақсатында себуге негізделеді. Зерттеуге 1 тәуліктен аз уақыт кетеді. Оған Гисс ортасына себу арқылы ( қысқа және ұзын "ала қатарға") бактериялардың қантеріткіштік белсенділігін (көмірсуларды ферментациялау қабітеттілігі) бағалау мысал бола алады.

Б а к т е р и я л а р д ы ң     б и о х и м и я л ы қ     н ы ш а н д а р ы н

"ш ұ б а р  қ а т  а р"    о р т а л  а р ы н ы ң     к  ө м е г і м е н     и д е н т и ф и к  а ц и я л а у.  Қысқа "ала қатардың" құрамында моно- және дисахаридтері –  глюкоза, лактоза, сахароза, мальтоза және 6 атомды спирт – манниті бар Гиссның сұйық орталары кіреді. Ұзын "ала қатарға" жоғарыда аталған көмірсулармен қоса құрамында әртүрлі моносахаридтер (арабиноза, ксилоза, галактоза, т.б.) мен спирттер  (глицерин, дульцит, инозит т.б.) бар Гисса сұйық орталары кіреді. Бактериялардың көмірсуларды ферменттеу қабілетін бағалау үшін қоректік орталарға ыдыраудың қышқыл өнімдерінің түзілуін (органикалық қышқылдарды) айқындауға мүмкіндік беретін индикаторлар (Андраде реактиві, т.б.) және СО2-ын айқындауға арналған "қалытқы" қосады.

Зерттелуші микроорганизмнің таза дақылын  құрықпен "ала қатар" ортасына себеді. Себіндіні 18-24 сағатқа немесе одан да көп уақытқа 37°С-тық термостатта инкубациялайды. Егер бактериялар көмірсуды қышқылдық өнімдерге дейін ферменттесе, ортаның түсі өзгергені байқалады; көмірсуды қышықыл мен газтектес өнімдерге ыдыратса түс өзгеруінмен қатар қалытқыда газ көпіршіктері пайда болады. Егер жартылай сұйық агарлы орталар қолданылса, онда газдың түзілуі бағананың ыдырауы бойынша тіркеледі. Ферментация болмаса орта түсі өзгермейді. Бактериялар барлық ферменттерді емес, тек Гисс ортасының құрамына кіретін көмірсулардың қайсы бір түрлерін ғана ыдырататындықтан ала-ала бейне байқалады. Сондықтан, көмірсулар мен түрлі түсті индикаторы бар орталар жиынтығын "ала қатар" деп атайды. (3.2.1. сурет; жапсырмада).

        Протеолиттік  ферменттерді анықтау үшін бактерия  дақылдарын пептон суына және 10-20 %-ті желатин бағанасына шаншып  егу жүргізеді. Желатиндегі себулерді 20-22°С та бірнеше күн бойы инкубациялайды. Протеолиттік ферменттері бар болған жағдайда бактериялар желатинді ұңғыма немесе төңкерілген шырша тәрізді бейнеде ыдыратады.

     Пептон суына себінділерде 2-3 тәуліктік 37°С-тық инкубациядан  соң, аминқышқылдарының ыдырау өнімдерін анықтаймыз. Ол аммиякқа, индолға, күкіртсутегіге және т.б. реакциялар қою арқылы жүзеге асады.

     А м м и я к  қ а   р е а к ц и  я. Лакмус қағазының жіңішке қағазшасын  қоректік ортамен жанаспайтындай  етіп тығынға бекітеді. Қағаздың көк түстенуі аммияктың түзілуінің айғағы.

     И н д о л ғ  а   р е а к ц и я. Эрлих  әдісі: бактериялық дақылы бар  шыны түтікшеге 2-3 мл эфир қосамыз  да оны жақсылап араластырып, үстінен бірнеше тамшы Эрлих  реактивін (хлорлысутекті қышқылы  бар парадиметиламидобензилальдегидтің спиртті ерітіндісін) тамызамыз. Индолдың бар болуында ортаның қызғылт боялуы байқалады, абайлап қабаттайтын болса қызғылт сақиналар түзіледі.

     К ү к і р т  с у т е г і г е   р е а к ц и я. Темір  сульфаты сіңген фильтірлік қағаздың  жіңішке парақшасын пептон суы бар шыны түткікшенің тығынына қыстырамыз. Қағаз қоректік ортаға тимейтіндей орналасуы қажет. Күкіртсутегі бөлінген кезде қағазды қара түске бояйтын ерімейтін темір сульфиді (FeS) түзіледі (3.2.1.). H2S өндірісін де осылайша бактерия дақылын H2S-ді айқындайтын реактиві (тұздар араласпасы: темір сульфаты, натрийдің тиосульфаты, натрий сулфиті) бар бағаналы қоректік ортаға шаншып егу арқылы анықтауға болады. Оң нәтижеде FeS-ің түзілуі есебінен орта қара түске боялады.

      К а т а л а з а н ы ң    б а р    е к е н д і г і н    а н ы қ т а у.  Бұйым шынысына 1-3 % сутегі тотығының ерітіндісін тамызамыз да бактериялық дақылы бар құрықты ендіреміз. Егер бактерияда каталаза ферменті болса ол сутегі тотығын оттегі мен суға, газ көпіршіктерін бөле отырып, ыдыратады.

     Бактериологиялық тәжірибеде  егер, идентификация үшін жеткілікті  болса,  кейде зерттелуші бактерияның  қантерткіштік және ақуызерткіштік  нышандарын пайымдаумен шектеледі. Қажет болған жағдайда басқа  белгілерін де зерттейді, мысалы, нитраттарды тотықсыздандыруын, амин қышқылдарын карбоксильдеуін, оксидаза, плазмокоагулаза, фибринолизин,  және басқа ферменттер түзуін.

     Таза дақылды идентификациялау  бойынша жұмыстардың нәтижелерін  хаттамалайды (кесте 3.2.1).

      Концентрацияланған субстраттар мен реакцияның ақырғы өнімдерін табуға едәуір сезімтал әдістерді қолдануға негізделген 2-ші ұрпақтық биохимиялық тесттер микробтық жасушада бар ферменттерді айқындауға мүмкіндік береді де осылайша, зерттеу үрдісінде бактерияны қосымша өсіріп-өндіруді талап етпейді. Бұл зерттеу мерзімін елеулі түрде қысқартуға (4сағ) мүмкіндік береді.

     Концентрацияланған  субстраттар мен реакцияның ақырғы  өнімдерін табуға едәуір сезімтал  әдістерді қолдануға негізделген 2-ші ұрпақтық биохимиялық тесттер микробтық жасушада бар ферменттерді айқындауға мүмкіндік береді де осылайша, зерттеу үрдісінде бактерияны қосымша өсіріп-өндіруді талап етпейді. Бұл зерттеу мерзімін елеулі түрде қысқартуға (4сағ) мүмкіндік береді.

     3-інші ұрпақтық биохимиялық тесттер хромогендермен немесе флюрохроммен таңбаланған субстраттарды қолдануға негізделген. Мұндай кешен боялмаған немесе флюоресценцияланбайды. Таңбаланған субстраттың микроб ферментімен бұзылуы кезінде таңба басап шығады да боялып немесе флюоресценцияланып айқындалады. Мұндай тесттер зерттеу материалының алғашқы себуі  кезінде алынған бірең-сараң бактериялық колонияларды толық биохимиялық идентификация үшін қолдануға мүмкіндік береді, яғни екі кезеңдегі таза дақыл бөліп алу үрдісін қысқартады.

     Зертханалық тәжірибеде адам ауруларының қоздырғыштары – микроорганизмдердің негізгі топтарын идентификациялау үшін  дайын микротест-жүйелер (МТЖ) қолданылады. Қазіргі МТЖ-де нәтижелердің  есебі мен олардың интерпритациясы автоматты түрде компьютерлік талдама жүйесі көмегімен жүзеге асады.

       Идентификацияның биохимиялық және молекулярлы-генетикалық әдістері.  Хемоидентификация – микробтық жасушаның химиялық құрамы бойынша идентификациясы. Кез-келген ағзаның құрамына биомолекулалардың 4 негізгі класы кіреді: нуклеин қышқылы, ақуыздар, көмірсулар, липидтер. Хемоидентификация ең алдымен микробтық липидтердің талдамасына негізделген. Өйткені, биополимерлер ішінде олар мономерлердің едәуір көптүрлілігімен сипатталады (алуан түрлі бактерияларда 300-ден астам әртүрлі май қышқылдары мен олардың туындылары табылған). Бұл липидтерінің сандық және сапалық құрамы бойынша (май қышқылдары, эфирлер, спирттер, хинондар мен т.б.) әралуан түрлерге жататын микробтарды ажырата білуге мүмкіндік береді. Микробты жасушаның химиялық құрамының талдамасы хромотография әдісінің көмегімен жүзеге асады. Едәуір кең қолданатыны газдысұйықтықты хромотография әдісі. Әдіс, көбінесе,  метаболизмдерінің негізгі өніміне жататын қысқа көміртегілік тізбекті  май қышқылдарының (9-20 көміртегі атомы) құрамы бойынша анаэробты бактерияларды идентификациялау  және де баяу өсетін бактериялар (микобактериялар) мен төменгі ферментативті белсенділігі бар бактериялардың идентификациялау саласында жиі қолданылады.

     К е с т е   3.2.1. Дақылдың морфологиялық және физиологиялық белгілері бойынша сипаттамасы (хаттама формасы)

Идентификацияның молекулярлы-генетикалық әдістері. Олар бактериялық ДНҚ талдамасына негізделген.

      1. Р е с т  р и к ц и я л ы   а н а л и з. ДНҚ-ны рестрикциялық  ферменттермен – спецификалық эндонуклеазалармен өңдейді. Олар нуклеотидтерінің белгілі бір реттілігі бойынша ДНҚ молекуласын кесіп бөледі. Одан соң алынған әрбір микроорганизм түрінің дарабоз ферменттердің талдамасын жүргізеді. Сонымен қатар, әдіс бактерияларды түрішілік типтеуде де қолданылады.

      2.  Д Н Қ   г и б р и д и з а  ц и я с ы. Кез-келген микроорганизм  өзінің геномында өз идентификациясы  үшін қолданылуына болатын белгілі-бір  жеке  дара дәйектілікке ие  болып келеді. ДНҚ-ның мұндай бөлімшелерін  табу әдісі нуклеин қышқылдарының комплементарлы тізбектіктерінің гибридизацияға қабіеттілігіне негізделген. Зерттеуді микробтық геномның дарабоз бөлімшелеріне комплементарлы және таңба тасымалдаушы (радионуклид, фермент немесе флюрохром) нуклеинді зондтардың – ДНҚ-ың біржіпшелі фрагменттерінің көмегімен жүргізеді. Таңдап алынған генетикалық фрагментке байланысты зондтар туыстық, түрлік немесе типтік спецификалы болып келеді. Гибридизация әдісінің жылдамдылығы мен жоғары сезімталдылығы зерттеу уақытын мейлінше қысқартуға мүмкіндік береді. Негізгі қолдану саласы қиын дақылданатын немесе баяу өсетін микробтардың (Mycobacterium, Neisseria, Campylobacter) идентификациясы болып табылады. Әсіресе, рибосомальді РНҚ-ны кодтаушы гендер талдамасына негізделген идентификация – риботиптеу әдісін ерекше атауға болады.

      3. П о л и  м е р а з д ы    т і з б е к т і к   р е а к ц и я  (ПТР). ПТР  әдісі үлгіде өте аз мөлшердегі  ДНҚ-ың дарабоз дәйектілігін табуға  мүмкіндік береді. Теория жүзінде  бастапқы дәйектіліктің бір көшірмесі  жеткілікті. ПТР әдісі микроорганизм геномының бастапқы бөлімшесін амплификациялауға (көшірме санын көбейтуге) негізделген. Осы мақсатпен үлгіні әйгілі геном фрагментінің аяқтамаларына комплементарлы, термостабильді ДНҚ-полимераза мен нулеотидтері – яғни, екі қысқа ДНҚ-олигомерлері (праймерлері) бар буферлі ерітіндіде инкубациялайды. Олигомерлерді ДНҚ-ның комплементарлы бөлімшелерімен гибридизациялаған соң, олар  бастапқы фрагментті көшіретін полимеразалар үшін праймерлер қызметін атқарады. ДНҚ-ның қосақталған спиральді тізбегін айыру үшін үлгіні бірнеше мәрте қыздырып, праймерлерді комплементарлы матрицамен қайта гибридизациялау үшін суытады. Процедураны 20-40 мәрте қайталайды. Мұнда геномның бастапқы фрагментінің көшірмелер саны экспоненциальді заңдылық бойынша көбейеді. Миллион еселік амплификация бірнеше сағатты ғана алады.

Тарау 4  САҢЫРАУҚҰЛАҚТАРДЫҢ МОРФОЛОГИЯСЫ МЕН ФИЗИОЛОГИЯСЫ

      Кіріспе. Саңырауқұлақтар Mycota патшалығының Eukarya доминионына жататын микроорганизмдердің алуан түрлі топтарын құрайды. Патшалық ішіндегі жіктеуі морфологиясына, көбею тәсілі мен сипатына, физиологиялық ерекшеліктеріне және басқа белгілеріне негізделген. Саңырауқұлақ жасушасы эукариоттарға тән ультрақұрылымға ие. Барлық саңырауқұлақтар жыныссыз көбеюге қабілетті, жетілген саңырауқұлақтар жынысты жолмен де көбейе алады. Бір түрдің өкілі жыныстық (телеморфты) және жыныссыз (аноморфты) даму фазаларында морфлогиясы, экологиясы және патогенді түрлеріне тән ауру тудыру қабілеттері бойынша елеулі айырмашылықтарға ие болуы мүмкін. Саңырауқұлақтар екі үлкен топқа бөлінеді: зең саңырауқұлақтары (жіпше тәрізді саңырауқұлақтар) және ащытқылар.

      Зең саңырауқұлақтарының морфологиясы. Зең саңырауқұлақтарының вегетативті денесі – гифтері – жіпше тәрізді пішінге ие. Әдетте, гифтердің қалыңдығы 2 мкм-ден асады,  бұл оларды қалыңдықтары 1 мкм-ден аспайтын актиномицеттерден ажыратуға мүмкіндік береді. Еркін өмір сүруші түрлерінің гифтер ұзындығы бірнеше метрге жетуі мүмкін. Жоғары сатылы саңырауқұлақтарда гифтер мембраналық жақтаушалармен – септалармен бөлінген, төменгі сатыдағыларында септалар болмайды. Гифтер даму үрдісінде тарамдалып, анастомоздар түзеді, соның есебімен шырмалған құрылым – мицелий түзіледі. Гифтің (мицелийдің) қоректік субстратқа ене өсуші және оның беткейімен өсуші түрлері болады.

         Зең саңырауқұлақтары  көбінесе әр түр өкілдерінде  морфологиясы, өлшемі және орналасуы  бойынша елеулі айырмашылыққа  ие вегетативті (жыныссыз) споралар  түзу арқылы көбейеді. Көптеген  түрлер ерекше репродуктивті (спора  алып жүруші) гифтер түзеді. Олардың құрылымы маңызды токсономиялық белгі болып та келеді. Жетілген саңырауқұлақтар жыныстық көбею барысында арнайы түзілістерде (аскаларда, базидияларда) орналасатын ерекше жыныстық споралар түзеді. Зең саңырауқұлақтарының Penicillium, Aspergillus, Mucor туыстарының морфологиялық белгілері  4.1-ші кестеде берілген.