Жалпы медициналық микробиология пәнінің зертханалық сабақтарына арналған оқу-әдістемелік құралы

       Өтпелі жарықтағы микроскопия (жарықты - жазықтық микроскопия). Бекіндірілген препараттардағы боялған объектілері зерттеу үшін қолданылады.

                                                  

 

                            

 

Сурет. 1.1. Микроскоптардың тәжірибеде жиі қолданылатын түрлері мен «Биолам» микроскопының құрылымы.

 

1 – микроскоп негізі (тұлғасы); 2 – бұйым үстелшесі; 3 – бұйым үстелшесін жылжытушы бұрандалар; 4 – препаратты қысып тұратын клеммалар; 5 – конденсор; 6 – конденсордың кронштейні; 7- конденсорды гильзада бекітуші бұранда; 8 – конденсорды жылжытушы тұтқа; 10 – айна; 11 – турбус ұстағыш; 12 – макрометриялық бұранданың ұстағышы; 13 – микрометриялық бұранданың ұстағышы; 14 – объективтердің револьвері; 15 – объективтер; 16 – иіргіш тубус; 17 – тубусты бекітетін бұранда; 18 – окуляр.

        Күнгірт-жазықтық микроскопия.  Боялмаған нативті препараттардағы микробтарды тірідей зерттеу үшін қолданылады. Күнгірт-жазықтықтағы микросокпия сұйықтықта қалқыған бөлшектерді (мысалы, микробтарды) бүйірлік жарықтандыру кезінде пайда болатын жарық дифракциясы құбылысына негізделген (Тиндаль әсері). Әсер биологиялық микроскоптың әдеттегі конденсорының орнына қондырылған пароболид- немесе кардиоид-конденсорлардың көмегімен жүреді. Бұл жарықтандыру әдісінде объективке объект беткейінен шағылысқан сәулелер түседі.

       

                                                        

Сурет 1.2. Иммерсиялық жүйедегі сәулелердің жолы.

                                                           n – сыну көрсеткіші

 

Нәтижесінде күнгірт аяда (фонда) (жарықтанбаған көрініс жазықтығы) жарқыраған бөлшектер көрінеді. Препарат мұндай жағдайда 1.4, б суретіндегідей (жапсырмадағы) болып көрінеді.

       Фазалы-контрастылы  микроскопия.  Нативті препараттарды зерттеуге арналған. Фазалы-контрастылы бейімділік микроскоптағы мөлдір объектілері көруге мүмкіндік береді. Жарық әртүрлі биологиялық объектіден әртүрлі жылдамдықта өтеді, ол объектінің оптикалық тығыздығына сай жүреді. Нәтижесінде көзбен қабылданбайтын жарық толқындары фазасының өзгеруі жүреді. Ерекше конденсор мен объективтен тұратын фазалық қондырғы жарық толқыны фазасы өзгеруінің амплитуданың көрінетін өзгерулеріне айналуын қамтамасыз етеді. Осылайша, объектілердің оптикалық тығыздығындағы айырмашылықтардың күшеюіне қол жеткізіледі. Олар позитивті немесе негативиті болып көрінетін жоғары контрасттылыққа ие болады. Позитивті фазалы контраст дегеніміз, -  жарқын көру жазықтығындағы объектінің күнгірт бейнесі, негативті - күнгірт фондағы объектінің жарқын көрінуі. (жапсырмадағы 1.4 суретті қара).

      Фазалы-контрастылы  микроскопия үшін әдеттегі микроскоп  пен КФ-1 немесе 

КФ-4 қосымша фазалы контрастты қондырғылары (1.5 сурет), және де арнайы жарықтандырғыш қолданады.

      Люминесцентті (немесе флюоресцентті микроскопия).

       Фотолюминесценция құбылысына негізделген.

       Люминесценция  – сыртқы сәулелендіру әсерінен  заттардың жарқырауы. Ол жарықтық, ультракүлгін, иондаушы және т.б. сәулелер болуы мүмкін. Егер люминесценцияланушы объектіні көк түспен жарықтандырсақ онда ол қызыл, сарғыш, сары немесе жасыл түстер бөліп шығарады. Нәтижесінде объектінің түрлі-түсті бейнесі пайда болады. Сәулелеуші жарықтың толқын ұзындығы  (люминесценция түсі) люминесценцияланушы заттардың физика-химиялық құрылымына тәуелді болады.

Биологиялық объектілердің алғашқы люминесценциясы (меншіктік немесе биолюминесценция) меншікті люминесценциялаушы заттардың есебімен алдын - ала боялмай-ақ байқалады, екіншілік (жүргізілген) люминесценция препараттарды арнайы люминесценциялаушы бояғыштармен – флюрохромдармен (ауромин, коринофосфин, қызғылтсары акридин т.б.) бояу нәтижесінде пайда болады. Люминесцентті микроскопия әдеттегі микроскопталармен салыстырғанда мынадай бірқатар артықшылықтарға ие: тірі микробтарды зерттеуге және контрасттылықтың жоғары дәрежесінің арқасында олардың зерттеу материалындағы аз ғана мөлшерін де тауып алуға болады.

       Электронды микроскопия. Жарықтық микроскоптың айқындау қабілеті жетпейтін (0,2 мкм) өлшемдерге ие объектілерді көруге мүмкіндік береді. Электронды микроскоп вирустарды, әртүрлі микроорганизмдердің нәзік құрылымдарын, макромолекулярлы құрылымдарыды және басқа да субмикроскопиялық объектілерді көру үшін қолданылады. Мұндай микроскоптарда жарықтық сәулелерді электрон ағымдары алмастырады. Олардың белгілі бір жылдамдықтардағы толқын ұзындықтары 0,005 нм болады, яғни, көрінетін жарықтың толқын ұзындығынан 100 000 еседей кіші. Электронды микроскоптың 0,1-0,2 нм ге жететін жоғары айқындаушы қабілеті 1 000 000 ға дейін жететін жалпы тиімді үлкейтулерге қол жеткізуге мүмкіндік береді. «Жарықтандырушы» типтегі қондырғылармен қатар объект беткейінің релефттік бейнесін көрсететін сканерлейтін электронды микроскоптар қолданылады. Бұл қондырғылардың айқындаушы қабілеті «жарықтандырушы» типіндегі электронды  микроскоптардан әлдеқайда төмен.

Сурет 2.1.4.

       

 

    Микроскоппен  жұмыс істеу ережесі.  Кез-келген жарықтық микроскоппен жұмыс істегенде көру аймағы мен препараттың және оның әртүрлі объективтермен микроскопиясы дұрыс жарықтандырылуы қажет. Жарықтандыру шынайы (күндізгі) немесе жасанды болуы мүмкін. Жасанды жарықтандыруда арнайы жарық көздері – жарықтандырғыштың әртүрлі маркалары пайдаланылады.

       Препараттарды  иммерсиялық объективті микроскоптармен  көргенде мынадай тәртіптерді  қатаң сақтау керек:

1. бұйым шынысында дайындала боялған препаратқа бір тамшы иммерсиялық май тамызып, бұйым үстелшесіне қысқыштармен бекіте орналастыру;
2. револьверді 90х немесе 10х  иммерсиялық объектив таңбасына дейін бұру;
3. объектив май тамшысына дейін енгенше микроскоптың тубусын түсіру;
4. макрометриялық бұранданың көмегімен шамалап фокусты қою;
5. бір ғана айналым шегінде бұрай отырып, микрометриялық бұрандамен препараттың нақты фокустенуін жүргізу. Объективтің препаратпен жанасуына жол бермеу керек, өйткені ол жабынды шынының немесе объективтің фронтальді линзасының қирауына әкеп соқтырады. (иммерсиялық объективтің еркін қашықтығы 0,1-1 мм).

      Микроскоппен жұмыс аяқталған соң иммерсиялық объективті майдан тазарту және револьверді кіші 8х объективіне қою қажет.

      Күнгірт жазықты  және фазалы-контрастылы микроскопияда  нативті препараттар («жаншылған»  тамшы т.б., 2.1 тақырыпты қара) қолданылады; микроскоппен көру 40х объективпен немесе 1,25тен 0,85 ке дейінгі сандық апертураны реттеуге мүмкіндік беретін ирис-диафрагмасы бар арнайы иммерсиялық объективпен жүргізіледі. Бұйым шынысының қалыңдығы 1-1,5 мм -ден, жабынды шынының қалыңдығы 0,15-0,2 мм -ден аспау керек.

 

 

Тарау 2             БАКТЕРИЯЛАРДЫҢ МОРФОЛОГИЯСЫ

      МЕН УЛЬТРАҚҰРЫЛЫМЫ

 

       Кіріспе.  Бактериялар Bacteria доминионына жатады. Олар бір жасушалы прокариоттық (ядроға дейінгі) микроорганизмдер болып табылады. Бактериялық жасуша өзіне тән құрылымдық ерекшелікке ие, және оның эукариотты жасушадан елеулі айырмашылықтары бар.

      Бактериялардың көбісінің  микроскопиялық өлшемдері жарықтық  микроскоптың айқындаушы қабілетінің  шегінде (0,2 мкм ден жоғары) болады, бірақ, одан да ұсақ бактериялар да (риккетсия, хламидия) кездеседі.

      Жасушаның пішіні бактериялардың маңызды таксономиялық белгілері қатарына жатады. Жасуша пішіні бойынша бактериялар шар тәрізді, таяқша тәрізді және иректелген болып бөлінеді ( 2.1. сурет).

      Шар тәрізді бактериялар – кокктар (coccus – дән) дұрыс бітімді сфералы немесе эллипсті пішінге ие.  Кокктар өздеріне тән жиылыстар түзеді, бұл олардың бөліну ерешеліктерінен және бөлінген соң жас жасушалардың бір-бірімен байланысты үзебеу қабілеттерінен туындайтын қасиет. Кокктар ретсіз орналасуы (микрококктар), жұптаса (диплококктар), тізбектесе (стрептококктар), 4 тен (тетракокктар) және 8 ден (сарциналар) тұратын пакеттер түрінде, жүзім шоғырына ұқсайтын жиылыстар түрінде (стафилококктар) орналасуы мүмкін. Диплококктар мен стрептококктар жас жасушалар бір-бірінен алшақтай алмайтын жағдайда, бір жазықтықта бөлінгенде түзіледі. Ал 2 және 3 жазықтықтағы ретті бөліну тетрококктар мен сарциналардың пайда болуына әкеп соғады. Стафилококктар әртүрлі жазықтықта бөлініп түзіледі.

      Таяқша тәрізді  бактериялар (бациллалар) өлшемі жағынан, жасуша пішіні мен шеттері  жағынан, және де орналасуы жағынан  әртүрлі болып келеді. Олар жіңішке, жуан, екі шеті жуандау немесе  күрт шабылған болып келеді. Біреулері  жалқы жасушалар, енді бірі жұптасқан – диплобактериялар, үшіншілері тізбектелген – стрептобактериялар түрінде орналасады.

Иректелген пішінді бактериялар иілген тақша түрінде болады да иірімдері 1/4 - 1/2 (вибриондар) немесе 1-3 иірімді (спириллиалар) және спираль тәрізді (спирохеталар) болып келеді. Жіпше тәрізді және тарамдалған пішіндер актиномицеттерге тән.

Бактериялардың дифференсацияланған, яғни, жіктеле жетілген ядросы болмайды. Бактерияның нуклеоиды - ядроның үйлесі мембранамен қапталмай, цитоплазмада еркін орналасады. Бактерияларда жасуша ішілік мембраналар және олармен шектелген органеллалар болмайды. Плазматикалық мембрана (ПМ) барлық бактериялық жасушаларға тән жалғыз мембрана болып келеді. Бактерияның цитоплазмасында рибосомалар еркін орналасады, және де онда енбелер, ал кейбір бактерияларда сыртқы ортаның қолайсыз факторлаынан қорғап тұрушы хитинді қабықша - споралар болады. (2.2). Споралар терминальді, субтерминальді және ценральді орналасуы мүмкін. ПМ сыртында жасушалық қабырға (ЖҚ) орналасады. Бактерияның ЖҚ құрылымы жағынан топқа бөлінген: фирмикуттер және грациликуттер. ЖҚ сыртынан капсула немесе капсулатәрізді түзіліс қаптап тұруы мүмкін.

  Көптеген бактериялардың сыртқы  қозғалыс органеллалары – талшықтары  болады (сурет 2.1.1.). Ал кірпікшелері (фимбриялары, пилилері) жасуша беткейінде орналасып, бактериялардың әртүрлі субстраттарға (адгезия), бір-біріне (когезия) жабысуына және конъюгация кезінде бір-бірімен байланысуына мүмкіндік береді.

Бактериялардың морфологиясы мен ультрақұрылымын  зерттеу үшін жарықтық және электронды микроскоптар қолданады 

Сурет  2.1.   

 

.

 

 

 

 

 

Сурет 2.1.1 Бактериялардың талшықтары                                                     

             а–монотрих;  б–лофотрих;        

             в–амфитрих; г–перитрих.                                                                                                                       

                                                          

 

    

 

 

 

                                                       Бактериялардың морфологиясын әдетте бекіндіріліп боялған препараттарды жарықтық микроскоппен көру әдісі арқылы зерттейді. Бактерияларды бояу үшін әртүрлі бояғыштар қолданады. Көбінесе анилин бояғыштарын (метилен көгі, генциан күлгін, малахитті жасыл, фуксин т.б.) пайдаланады.

 Электронды микроскоптың көмегімен бактериялық жасушаның кесінді келбетін көру арқылы оның қандай құрылымдық элементтерден тұратынын анықтауымызға болады. Сурет 2.1.2.,2.1.3.

Сурет 2.1.2.

      Бояу негізін  бактериялық жасушаның құрамындағы  химиялық қосылыстар мен бояғыштар арасындағы күрделі химиялық және физика-химиялық реакциялар құрайды. Оның үстіне, жасушаның құрылымдық құрамалары әртүрлі бояғыштармен боялуы мүмкін. Цитоплазма (әсіресе бекіндірілген  жағындыларда) негізгі бояғыштармен (метилен көгі, кристальді күлгін, везувин т.б.) ұқсастықтарға ие. Бактериялардың әртүрлі құрылымдарын анықтау үшін бейтарап және қышқылдық бояғыштар қолданады. Бояудың қарапайым және күрделі әдістері болады. Қарапайым бояу әдісінде препаратты бір ғана бояғышпен бояумен шектеледі де онымен бактерияның пішіні мен өлшемін пайымдауға мүмкіндік туады. Препаратты күрделі әдістермен бояғанда (Грам, Циль-Нильсен т.б. бойынша) кезекпенен бірнеше бояғыштарды және қосымша өңдеу тәсілдерін қолданады.

      Тинкториялық қасиет деп - жасушаның бояғыш заттарды қабылдап, өзінде ұстап тұруын айтамыз, ол бактерияның химиялық құрамы мен құрылымдық ерекшелігіне тәуелді. №2.1.3. суретте тинкториялық қасиеттері бойынша бактериялардың екі топқа бөлінгендігін көре аламыз.

     Күрделі бояу әдістері  бактерияларды осы белгілері  бойынша дифференциациялауға мүмкіндік  бере отырып, диагностикалық маңызға  ие болады. Тәжірибеде бактериялардың  құрылымдық құрамаларын анықтауда (талшықтарын, капсуласын, әртүрлі цитоплазмалық  енбелерін) қолданатын арнайы күрделі бояу әдістері қолданылады.

      Күнгірт-жазықты  және фазалы-контрастылы микроскопия  әдістерінде бактерияларды тірідей  зерттеуге, әсіресе, қозғалғыштығын  анықтауға мүмкіндік туындайды. Ол үшін нативті препараттар  дайындайды.

      Электронды микроскопияны бактериялардың ультрақұрылымдарын (ұсақ ұйымдастырылуларын) зерттеуде қолданады. Оны жалпы көрінісі мен көрсету мүмкіндігі №2.1.4 суретте көрсетілген.

Грамтеріс және грамоң бактериялар қабықшасының құрылымдық кестесі

 

  Тақырып 2.1.  БАКТЕРИЯЛАРДЫҢ  МОРФОЛОГИЯСЫ  МЕН  ОЛАРДЫҢ

                            ТИНКТОРИЯЛЫҚ  ҚАСИЕТТЕРІ.  ҚАРАПАЙЫМ  БОЯУ 

                            ӘДІСТЕРІ

 

▲   Әдістемелік нұсқаулар.

     Микроскопиялық  зерттеулер үшін препараттар  дайындау. Препарат дайындау үшін зерттелетін материалды шыны түтікшелерден, колбалардан, Петри табақшаларынан бактериологиялық құрықпен немесе стерильді тамызғышпен алады. Кейбір жағдайда арнайы инелер қолданылады.