Бруцеллез сельскохозяйственных животных

Основной серологической диагностикой бруцеллеза и других инфекционных болезней является взаимосвязь между антигеном и антителом, которая заключается в обнаружении специфических антител в сыворотки крови животных.

Наиболее распространенными и показательными серологическими методами диагностики все еще являются РА (реакция агглютинации) в пробирках, пластине, РСК (реакция связывания комплемента), РБП (пластинчатая реакция агглютинации с Роз – Бенгал антигеном или другим красителем), КР (кольцевая реакция с молоком), ИФА (иммуноферментный анализ) и др [28].

Реакция агглютинации (от лат. agglutinatio – склеивание) называется склеивание и выпадение в осадок микробных, кровяных или иных клеток под воздействием специфического антигена или антитела.

Впервые склеивание бактерий и скучивание их в комочки под действием сыворотки крови иммунизированного животного описали в 1890г M. Charrin и H. Roger. Однако этот феномен как специфическое явление, относящееся к реакциям иммунитета, оценен лишь после исследований M. Gruber и  Н. Durcham (1896).

Реакцию агглютинации в качестве диагностического теста при брюшном тифе у людей применил  F. Widal (1896) и метод был назван его именем.

Механизм агглютинации. По современным данным агглютинация – результат взаимодействия антигена (клетки) с многовалентными (два и более) антителами. Для выпадения образовавшегося комплекса в осадок, т. е. визуального проявления реакции, необходимо наличие электролита, хотя взаимодействие антигена с антителом и образование их комплекса могут происходить в безэлектролитной среде. Антиген, участвующий в реакции агглютинации, принято называть агглютиногеном, антитело – агглютинином, а образовавшийся комплекс антиген – антитело – агглютинатом. Эти термины условны, т. к. одни и те же антитела могут быть агглютинирующими, преципитирующими, комплементсвязывающими. Что касается антигена, то для применения его в реакции агглютинации требуется определенные условия. Во – первых, он должен быть корпускулярным в виде суспензии клеток или других дисперсных элементов, во – вторых, в электролитной среде должен образовывать устойчивую взвесь и не давать самоагглютинацию. Некоторые микроорганизмы в кислой среде могут вызывать самоагглютинацию.

Характер агглютината и скорость его образования зависят от свойств антигена. Безжгутиковые бактерии под действием специфических антител агглютинируются медленно в течение 18 – 24ч, образуя мелкозернистые комочки, тогда как бактерии со жгутиками агглютинируются сравнительно быстро в течение 2 – 4ч в виде крупных рыхлых комочков. Когда бактерии скучиваются друг с другом через свои жгутики посредством антител, получается очень нежный Н- агглютинат (нем. Hauch – дыхание, нежный налет). Образование мелкозернистых агглютинатов в результате склеивания непосредственно самих клеточных стенок было названо О- агглютинацией (нем. Ohne Hauch – без дыхания). Антигены, обусловливающие эти реакции, обозначены соответственно жгутиковый Н – и соматический О – антиген.

Отмытый центрифугированием агглютинат при суспендировании в дистиллированной воде распадается, приобретая вид первоначальной клеточной взвеси до реакции. При этом антитела, не освобождаются, что подтверждает правильность выводов о двухфазности агглютинации. В первой фазе адсорбируются агглютинины на поверхности клеток, без внешних изменений. Вторая фаза наступает только в присутствии электролитов и сопровождается образованием видимого агглютината. J. Bordet (1920) считал, что главную роль в процессе агглютинации играют электролиты, а антитела лишь повышают чувствительность клеток к агглютинирующему действию.

По известной теории «решетки» агглютинат образуется вследствии связывания разных клеток активными центрами двухвалентных антител. Хотя эта теория согласуется с современными данными, она не объясняет факты, подтверждающие двухфазность формирования агглютината. Анализ всех фактов с учетом современных данных позволяет предположить, что благодаря сигментной подвижности иммуноглобулиновых доменов активные центры многовалентных антител в безэлектролитной среде распологаются близко друг от друга и могут связываться лишь с близлежащими антигенными рецепторами на одной клетке. При определенной ионной силе раствора молекула иммуноглобулина приобретает такую информацию, при которой два активных центра будут располагаться достаточно далеко друг от друга, что позволяет связываться с антигенными детерминантами двух разных клеток. Благодаря этому происходит скучивание клеток с образованием крупного агрегата. Агглютинат в дистиллированной воде распадается из-за непрерывного обратимого процесса образования и диссоциации комплексов антиген – антитело.

Любая клетка, используемая в агглютинации, имеет многочисленные антигенные детерминанты, а освобождение связи между ними и активными центрами антител происходит не одномоментно: только в безсолевой среде из-за наступивших конформационных изменений в молекуле антител они перестают служить мостиками между различными клетками. Следовательно, не антитела помогают электролитам осуществить агглютинацию, как предполагал J. Bordet, а наоборот, электролиты придают молекулам антител соответствующую конформацию [29].

Активные центры антител благодаря сегментной гибкости в шарнирных участках молекул иммуноглобулинов удаляются друг от друга на достаточное расстояние, что обеспечивает связывание разных клеток с антигенными детерминантами.

Роль среды (электролитов, коллоидов) не ограничивается конформационными изменениями в молекуле антител. В определенной среде из-за уменьшения электростатических сил отталкивания клетки сближаются друг с другом, что также способствует агглютинации. Это подтверждается и некоторыми экспериментальными данными. Установили, что объем одного и того же количества эритроцитов неодинаков в различной среде, например, его меньше в растворе декстрана, чем в физиологическом растворе хлорида натрия. Растворы декстрана, желатина и другие коллоиды, а также гипертонические растворы солей усиливают агглютинацию. На этом основана агглютинация в концентрированном растворе хлорида натрия, сернокислого амония, сернокислых солей цинка, свинца и кадмия, а также агглютинация в коллоидной среде: в плазме крови, желатине, гепарине, гуммиарабике, декстране, пектине для усиления агглютинации применил сывороточный альбумин и этот метод ошибочно назвал конглютинацией, полагая, что реакции способствует особый фактор типа конглютинина, находящийся в сыворотке крови. [30].

Прозона. Известно парадоксальное явление, заключающееся в том, что с некоторыми иммунными сыворотками, как правило, с высокоактивными, в малых разведениях отсутствует агглютинация при наличии ее в более высоких разведениях. Это явление получило название феномен прозоны.

В ветеринарных лабораториях сыворотку крови животных изучают в разведениях, соответствующих минимальным диагностическим титрам. Массовые исследования проводятся лишь с одним, как правило, наименьшим разведением. При этом из-за прозоны существует риск у явно больных животных результат считать отрицательным.

Анализируя возможные механизмы явления прозоны, Л. А. Зильбер (1958) указывал, что исчерпывающего объяснения ему нет. Успехи современной иммунологии, достигнутые в области изучения природы антигенов и структуры антител, также не внесли ничего существенного в решение этого вопроса.

Возможной причиной прозоны некоторые исследователи считают присутствие в сыворотке крови неполных антител или их более высокий авидитет к антигену по сравнению с полными антителами.

Мы исследовали связь феномена прозоны с наличием в сыворотке крови неполных антител. Опыт проводили на 1140 сыворотках крупного рогатого скота, больного бруцеллезом. Уровень агглютининов (полных антител) определяли в реакции агглютинации, о содержании неполных антител судили по разнице титров сывороток в реакции Кумбаса и РА.

Титры антител в реакции Кумбаса во всех случаях превышали титры в РА на 3 – 5 двукратных разведений. Из исследованных проб только 39 (3,1%) давали прозону в РА в начальных разведениях 1:20 – 1:160.

В пробирках, где установлена прозона, во всех случаях получены резко положительные результаты в реакции Кумбаса. Соотношение титров агглютининов и неполных антител в сыворотках с прозоной не отличались от такого показателя сывороток, не давших прозону.

В 34 сыворотках с прозоной в реакции агглютинации определяли авидность антител по отношению к бруцеллезному антигену для РА. Показателем этого свойства служила степень истощения антител в результате контактирования 0.1 мл сыворотки с 1 млрд. бруцелл. Разница логарифмов титров полных антител до и после истощения составляла 1,98 ± 0,54. Следовательно, последние оказались более авидными. Однако разница между показателями авидности полных и неполных антител была статистически недостоверной (р >0,1).

Известно, что агглютинины в сыворотках крови крупного рогатого скота после нагревания при 70°С ведут себя как неполные антитела. Мы исследовали блокирующее действие 79 бруцеллезных сывороток, обработанных указанным способом. Все они до инактивации имели титры в РА 1:800 – 1:6400 и не давали прозону. С нагретыми сыворотками РА ставили в двух рядах. В один из них вносили по 0,05 мл высокоактивной агглютинирующей сыворотки в разведении 1:20, другой служил контролем и в нем во всех случаях агглютинации не было. В опытных пробирках иногда также наблюдали отсутствие реакции в первых пробирках с малыми разведениями сывороток. Такой блокирующий эффект давала 21 из 76 сывороток.

Таким образом, феномен прозоны нельзя объяснить только содержанием в сыворотке неполных антител или их более высоким авидитетом, хотя значение этих факторов отрицать тоже нельзя. Видимо, для появления прозоны необходимы некоторые физико-химические изменения белков сыворотки крови, о чем свидетельствует более частое блокирование антигена сыворотками, инактивированными при 70°С [31].

РА для диагностики бруцеллеза людей предложили 1887г, Райт и Симплом;

Коз в 1905г Заммит; крупного рогатого скота в 1909г Кристенд.

РА оценивают в международных единицах (МЕ) .

Положительной реакция считается при склеивании антиген + антитело на 50% (2 креста) у крупного рогатого скота при разведении сыворотки 1:100 и выше. Многие авторы отмечали ее диагностическую ценность, считают, что она высокоспецифична, проста в постановке и позволяет выявлять бруцеллезных животных на ранних стадиях развития инфекционного процесса.

Некоторые ученые отмечают, что недостатком его является невысокая выявляющая способность, другие сходятся во мнении, что РА по чувствительности уступает РСК.

При искусственном заражении животных агглютинины в основном обнаруживались на 14-30 день. [32].

С целью повышения активности специфической агглютинабельности РА Н.П. Иванов предлагает тщательно отмывать убитые бруцеллы, от других антигенных комплексов.

Многие исследователи определили, что повышение концентрации NaCl в растворе повышает диагностическую активность РА.

Ряд исследователей считают, что при постановке реакции  сыворотка не должна быть гемолизированной, т.е. должен быть свободным от взвешенных частиц.

Некоторые исследователи считают, что РА несмотря на высокую чувствительность, специфичность может давать ложные результаты.

Таким образом, разработка антигена для РА все еще является важной задачей [33].

 

2.5. Пластинчатая реакция агглютинации (РБП)

Gard - test (РБП) продолжена Р. Nicoletti в 1967г., принцип реакции состоит в том, что присходит взаимодействие антигена с антителом, это является основой многих реакций и по своей сущности весьма подобен РА за исключением того, что этот антиген окрашен Rose Bengal, но краситель можно заменить другим кислотоустойчевым красителем (РН-3,65) и применяется он как экспресс – метод, диагностическую ценность которого отмечают многие исследователи [34].

Также высокую чувствительность и специфичность РБП отмечают и другие исследователи.

В постсоветском пространстве РБП - тест начали применять с 1978 года [35].

Основой высокой активности названного теста является РН среды (РН-3,65) в этих условиях создаются условия для проявления активности IgG, участвующего в реакции связывания комплемента.

При этом высокую активность и специфичность многие ученые обясняют этому способствует кислая среда антигена. [36].

Несмотря на положительные отзывы, ряд исследований отмечают недостаточную диагностическую ценность РБП - теста другие отмечают достаточно – высокую диагностическую ценность [37].

Некоторые ученые утверждают, что позитивные показания РБП - теста совпадают с выделением культуры.

Предложенный для практики тест показал высокую диагностическую активность в условиях производства, но противоречивые высказывания исследователей требуют углубленных исследований как при совершенствовании теста, так и при применении его при различных эпизоотических ситуациях по бруцеллезу животных [38].   

 

2.6. Химиотерапия

Термин «химиотерапевтические средства» связан с ранними этапами развития микробиологии, когда противомикробные препараты получали химическим путем. Несмотря на колоссальное разнообразие химиотерапевтических препаратов их можно объединить в несколько основных групп – в зависимости от происхождения, структуры и механизма действия. Для терапии инфекционных болезней, вызываемых микробами, вирусами и многоклеточными паразитами применяют разные препараты. Именно в таком порядке их и уместно рассматривать.

Из группы антимикробных химиотерапевтических препаратов наибольшее значение в основном антибиотики, аминогликозиды, сульфаниламиды, фторхинелы и др [39,40].

Отрицательная эпизоотологическая ситуация по  бруцеллезу сельскохозяйственных животных создавшаяся в республике требует от научных и практических ветеринарных специалистов срочных неотлагательных мер направленных на купирование инфекционного процесса. При этом наиболее перспективным направлением является антибиотикотерапия. Известно, что не ко всем антибиотикам чувствительны патогенные микроорганизмы, и поэтому перед применением их надо обязательно проверить на чувствительность микроорганизмов (бруцелл) к ним.

Однако при проведении работ мы должны учитывать следующие факторы: действие антибиотиков в основном кратковременное; одни из них обладают бактериостатическим действием; другие – бактерицидным; одни организмы в основном проживают внутри клетки; другие – внеклеточные.

Многие исследователи пытались при помощи антибиотиков бороться с возбудителем бруцеллеза, получали положительный эффект: другие - нет. Это связано с тем, что возбудитель живет внутри клетки, при длительном персистировании находит такие места обитания, куда затруднен доступ фагоцитов лимфоцитов и других влияний, могущих отрицательно сказаться на их жизнедеятельности. Поэтому кроме веществ пролангирующих действие препарата, необходимо, подбирать вещество усиливающие работу иммунной системы. Работая в этом направлении важно подобрать препараты активизирующие действие иммунной системы (иммуностимуляторы). Насколько правильно будет подобран комплекс препаратов, настолько эффективно будет происходить борьба, борьба за здоровье организма, за купирование инфекционного процесса и снижение риска распространения ее среди других животных [41,42].