Вірус плямистого в"янення томатів

Іноді додаткові різних продуктів  РНК з 5 Кб спостерігалося відповідність  розміру з вірусною геномної РНК  М сегменту з очищеного RNPs. Ні субгеномних  довжину РНК продуктів з розміром, що може відповідати впуть мРНК (N мРНК, 1,2 Кб; НЗ мРНК, 1,7 Кб) не спостерігалося.

 

Figure8: У пробірці синтез  РНК режисер віріонів впуть  за відсутності ретикулоцитів  лізата.

Впуть РНК синтезували  заново в присутності 32Р-CTP була вирішена на 1,5% агарозному гелі, а потім змив з Hybond-N. Група, Нозерн мічених РНК  синтезується в пробірці шляхом впуть. Лейн 1, тепло інактивованих вірусів; провулок 2, РНК, синтезованих в пробірці під час відсутності ретикулоцитів  лізат; провулок 3, РНК, синтезованих в  пробірці під час відсутності  ретикулоцитів лізат і в присутності  екзогенного AMV RNA4. Група B, Нозерн-гібридизації панелі з пасмо конкретних датчик виявлення VC-S сенсі РНК та N мРНК. Лінії 1-3, як у панелі; lane4, РНК впуть-інфікованих Rustica Nicotiana. Гібридизація була виконана тільки після повного розпаду  радіоактивного сигналу з пульта З впуть транскрипції, як відомо, з ініціативи кришка вихопивши (Kormelink та ін, 1992в;. Ван Poelwijk та ін, 1996.), Відсутність  відповідних донорів кришка може мати було обмежуючим фактором для  виникнення транскрипції. Щоб перевірити цю гіпотезу, екзогенні AMV, яка раніше було показано, що відповідного донора кришка для впуть ініціації транскрипції в природних умовах (Duijsings та ін., 1999), був доданий в реакції в  пробірці.

Хоча 5 КБ групи може здатися  більш поширеним в профіль  продукції РНК, в цілому, в ході повторних аналізів профіль не відрізняється  від реакції, які проводилися  за відсутності кришки донорів. Більш  того, ні потенціал N або НЗ стенограми можна було спостерігати після Північної  гібридизації пляма, вказавши, що додаткові  наявність кришки донорів було недостатньо, щоб стимулювати транскрипції.

У цілому, результати показали, що за відсутності ретикулоцитів  лізат очищених віріонів здатні тільки геному реплікації, як показано на виробництво  геному довжиною S і M РНК і (візуальної) відсутність субгеномних мРНК довжиною.

2,12 синтез РНК у присутності  ретикулоцитів лізат

Для Germiston вірусів і Ла-Кросс-вірус, як представляють тварин зараження  членів буньявірусов, додавання ретикулоцитів  лізат (РРЛ), як повідомляється, призводять до значної стимуляції транскрипції в пробірці, як показали синтез субгеномних видів РНК (Беллока та ін, 1987b;. Vialat та ін, 1992) .. Щоб перевірити наявність РРЛ буде також стимулювати впуть транскрипції в пробірці, RdRp аналізи проводилися містять РРЛ, як описано в Матеріали і методи.

У присутності РРЛ, загальна швидкість синтезу РНК була значно зросла. Хоча навряд чи або не геному довжини молекули РНК було видно, велика кількість різних менше продуктів  не спостерігалося, потенційно представляють N і НЗ мРНК приблизно 1,2 Кб і 1,7 кб, відповідно (Kormelink та ін., 1992b). Після розпаду радіоактивного сигналу, Північної гібридизації блот показав, що основними 1,2 Кб група взаємодіє  з пасмо конкретних зонд для гена N, і comigrated з N мРНК ізольовані від Rustica TSWVinfected Н. про те, що це ймовірно, представляв N мРНК.

Незначні 1,7 Кб група не показують  гібридизації з пасмо конкретних зонд для гена НЗ, хоча і comigrate з НЗ мРНК ізольовані від впуть-інфікованих Rustica Н.. Відсутність прямий сигнал гібридизації, швидше за все, із-за низької кількості  заново синтезований продукт, у порівнянні з інтенсивністю смуги передбачуваного N мРНК. Додавання екзогенного AMV RNA4 не змінювати профіль молекул  РНК, синтезованих в присутності.

Ці результати показали, що додавання РРЛ вельми стимулювало  синтез РНК і, здавалося, індукують  транскрипцію, про що свідчить виробництва  субгеномних вірусних молекул РНК

.

 

Малюнок 9: Вплив на РРЛ в пробірці синтез РНК режисер віріонів впуть.

Впуть РНК синтезували  заново в присутності 32Р-CTP була вирішена на 1,5% агарозному гелі, а потім змив з Hybond-N. Група, Нозерн мічених РНК  синтезується в пробірці шляхом впуть. Лейн 1, тепло-інактивованих вірусів; провулок 2, РНК, синтезованих в пробірці під час відсутності РРЛ; провулок 3, РНК, синтезованих в пробірці в  присутності РРЛ; провулок 4, РНК, синтезованих в пробірці в присутності обох РРЛ та AMV RNA4 . Лінії, відмічені *: короткі  експозиції. Конфіденційність В і  С; Гібридизація сигнал смугами руху в панелі з пасмо специфічних  зондів виявлення VC-S сенсі РНК і  мРНК N (B) і V-сенсі S РНК і мРНК НЗ (С). Лінії 3-4, як у панелі; Лейн 5, загальною  РНК з впуть-інфікованих Rustica Nicotiana.

У присутності РРЛ, у синтезі  РНК пробірці збігається з кришкою  вихопивши. Щоб перевірити синтез РНК  у присутності РРЛ дійсно справжні вірусної транскрипції, РНК продукції  були проаналізовані на наявність не-вірусних послідовностей на їх кінці 5 ', яка буде вказувати на кришку вихопивши. Цей  процес вимагає присутності обмежений  донорів лідер, який може бути присутній  в РРЛ як фрагментовані (мікрококковой  ендонуклеази-відколу) мРНК глобіну.

Раніше, RT-PCR був розроблений  протокол вибірково підсилюють вірусної мРНК з невірусних лідер послідовності, та дискримінацію їх з геномної вірусної РНК (аль Duijsings та ін., 1999). Використовуючи цей підхід, очищеної РНК продуктів  в пробірці

транскрипції реакції  зворотної транскрипції використанням  конкретних внутрішніх грунт для  впуть N, Н • м, Г. П. генів відповідно, а потім за допомогою ПЛР з  ген-специфічних праймерів і праймера відповідний 5 'перші 11 NT з α-і β-мРНК глобіну (див. Матеріали і методи). З цієї процедури, продукти очікуваних розмірів були посилені відповідні потенційні мРНК впуть. Це було також підтримане відсутність продуктів ПЛР з-під  контролю реакції з використанням  тепла-інактивованих вірусів. Клонування і секвенування продуктів ПЛР  отримані зі стенограми N гена показало, що вони дійсно передували перші 13-14 нуклеотидів  α-і β-глобіну мРНК, про те, що ініціації  транскрипції на кришку вихопивши відбулася  в пробірці.

 

Малюнок 4: RT-PCR аналіз у пробірці синтезованих впуть РНК.

РНК синтезується в пробірці в присутності РРЛ (з використанням  активних вірусів у провулках  і 1-3 тепла інактивованих вірусів  у провулках 4-6) була зворотною транскрипції з використанням внутрішніх праймерів для генів впуть N, Н • м, або GP, а потім за допомогою ПЛР з використанням внутрішнього праймерів для тих же генів у поєднанні з грунтовкою для конкретних 5 '11 NT або α-глобіну (верхня панель) або β-глобіну (нижня панель) мРНК. Вірус використовується і впуть гени зазначених вище смуг. Лейн м: 100 б.п. розмір маркера.

Попередні дослідження вже  продемонстрували вимога для єдиної бази додаткових між кришкою донорів  РНК і шаблон впуть (Duijsings та ін., 2001). Перевагу було відзначено для відрахування в кришку донорів між позиціями 12 і 18 з обмежений 5'-кінця, з позиції 16 оптимальних. Цей залишок може пар основ з кінцевої залишок U або, хоча й менш ефективно, третій від кінця залишок U в шаблоні  впуть. Крім того, залишок G замість  також прийняте, в результаті чого потенційні внутрішні бази сполучення з передостаннього залишку З  вірусної шаблону.

Цікаво, що α-глобіну мРНК містить дінуклеотід AG в позиціях 14 і 15, пропонуючи можливість подвійного спарювання підстав. Ця база спаровування спостерігається як в кінцевому  підсумку дінуклеотід UC і внутрішньо на другий дінуклеотід UC з шаблону. Так як α-глобіну мРНК була використана  впуть як кришка донорів, додаткові  мабуть, не обмежується однією спарювання підстав. Тим не менш, ще належить визначити, чи є розщеплення донора відбувся після або після вирахування G.

Більш інтригуючим є ситуація для β-глобіну мРНК, яка також  пропонує можливість подвійного спарювання підстав, хоча в даному випадку з  Г. А. дінуклеотід на позиції 13 і 14. При  цьому кришка донорів як одного спарювання підстав, з A14 з кінцевою залишок U з  шаблону впуть, і двічі спарювання підстав, з G13A14 з передостанній і  третій від кінця CU дінуклеотід, не спостерігалося.

Наявність залишків G попередніх A14 може бути причиною того, що A14 є кращим A16, положення, яке було раніше встановлено, що оптимальна (Duijsings та ін., 2001).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблиця 2: 5'-кінцевий послідовності  вірусного гена стенограми N синтезовані  в пробірці.

 

Послідовність результатів  показані в пробірці синтезованих мРНК впуть N 5 'лідера послідовностей, отриманих  з екзогенних (AMV4, AMV3) або ендогенних (α-глобіну, β-глобіну) мРНК. послідовностей Номери впуть лідер виділені курсивом. Донорів залишок, який передбачається пар основ з вірусною шаблон представлений  жирним шрифтом. Послідовності підкреслив подавати додаткові вставлені залишків.

 

Рисунок 10: Можливі спарювання підстав  взаємодії між глобіну мРНК донорів  шапку і впуть

шаблонів і стенограми послідовностей, отриманих.

Лідер послідовності, отримані з кришки донора підкреслив, нуклеотидів в  сміливих представляють вірусні  послідовності. Смугастий стрілки  вказують можливі прем'єр-і-перебудувати механізм.

3. Морфологія

Морфології і структурою геному та організації частка tospoviruses кілька функцій, з представниками інших  родів родини буньявірусов. Частинки поблизу pleiomorphic, 80-120 нм в діаметрі. Геном tospoviruses включає в себе три РНК  називають Великою (L), середній (M) і  малих (S). 5 'і 3' кінцеві послідовності  РНК зберігається. L РНК в негативному  сенсі, а M і S РНК ambisense в їх організації  геному. L РНК коди для РНК-залежної РНК-полімерази (RdRp). М РНК кодує  прекурсорів для двох структурних  глікопротеїнів, Г. Н. і GC, і неструктурних  білків, Нм. S РНК коди для нуклеокапсида  білка (N), а інший не-структурний  білок, НЗ. Три геномної РНК тісно  пов'язані з білком N формування рибонуклеопротеидов (RNPs). Ці RNPs укладені з в ліпідів  конверті, що складається з двох вірусів закодована глікопротеїнів, а також безліч похідних мембрани. Організації геному, продукти генів  і їх ролі показані. У зв'язку з  негативним strandedness геному, віріони  містять кілька молекул РНК-залежної РНК-полімерази, щоб ініціювати початкових раундах реплікації РНК віріона. Експресії геному сприяє через синтез субгеномних РНК.

Значний прогрес був досягнутий в нашому розумінні функціональної ролі різних генів впуть. 331-кДа RdRp кодуються L РНК служить багатофункціональний, реплікація пов'язаних білків і, як вважають, функції спільно з приймаючими  кодуванні факторів. Скринінг бібліотеки кДНК з західна Ф. використанням  впуть фрагменти впуть RdRp, передбачуваного  фактора транскрипції, який зв'язується з впуть RdRp був ізольований, який був показаний для прив'язки до впуть РНК і підвищення впуть  реплікації.

Ссавців клітин, що експресують  цього передбачуваного фактора  транскрипції підтримується впуть  реплікації. З впуть передається  кілька видів трипсів це ще належить з'ясувати, якщо подібні фактори  транскрипції існують і в інших  векторів трипса.

Призначення функцій різних генів впуть продуктів було зроблено з використанням непрямих підходів з зворотної генетики системи  на основі інфекційних клону кДНК поки не представляється можливим для  негативному сенсі РНК вірусу, таких як впуть. Використання непрямих підходів, функцій РНК-М закодовані глікопротеїнів і Нм недавно були розшифровані. Відсутність гена схожі  на Нм в інших родів родини буньявірусов припускає, що Нм служить функція, яка  полегшує впуть інфекції рослин. Вірус  руху у рослин опосередковано вірусу в кодуванні руху білка і аналогічна функція була запропонована для  Нм і наступні експериментальні дані підтримали цю гіпотезу.

Останнім часом роль Нм в життєвому циклі впуть був  досліджений в пробірці і в  рослинництві. Вірус-закодованих білків руху, як правило, пов'язуються з вірусної РНК вірусу і полегшують рух через plasmodesma. У пробірці вираженої Нм взаємодіяли  з N білка і пов'язаного ssRNA в послідовності-неспецифічних  чином. Члени сім'ї DnaJ були знайдені зв'язати Нм в дріжджах-два-гібридної  системи. Трансгенні рослини Nicotiana аЬасіт висловивши Нм проводиться симптомами інфекції впуть. Біохімічний аналіз цієї реакції рослин показав, накопичення  каллози, показник запуск заводу захисної реакції. Установчий вираз Нм і його подальше втручання в транспорті плазмодесми у функції могло  б привести до неправильного моделі зростання бачили в цих трансгенних  рослин. Більш прямі докази ролі вірусу Нм в русі був отриманий  гетерологічних досліджень доповнення використання інфекційних клону  кДНК вірусу тютюнової мозаїки (ВТМ) і замінюючи ВТМ генів з  геном Нм впуть. Ген Нм доповнюється руху недостатньо мутант ВТМ у  рослинах тютюну і сприяла велика відстань рух гібридною ВТМ-впуть Нм. Білка Нм, коли вони виражаються в рослинних, опосередкованих трубочку освіта в інфікованих протопластів.

Впуть мутантів вистачає конверт  не трипсів, що передаються про те, що детермінант для передачі трипса локалізовані на глікопротеїн-містять  конверт. Використання двох різних ізолятів впуть, які відрізняються у передачі трипсів, генетичні реассортантов (= pseudorecombinants) були отримані від coinoculating рослин як з ізолятів. У результаті реассортантов  були оцінені за їх здатністю бути передані трипса

і джерела геномної компоненти кожного з цих реассортантов  була визначена.

Тільки ті, які реассортантов  М РНК походить від трипсів, що передаються ізолювати зберіг трипса трансмісивність підтверджують  функціональний внесок М РНК трипса передачі (мал. 11). Послідовність зіставлення  глікопротеїну гени цих двох ізолятів показало, що точкова мутація відіграє критичну роль у визначенні трипса передачі. Ролі Г.Н. і GC в векторного взаємодії впуть-трипса починають  бути з'ясовані й обговорюються  в рамках передачі і епідеміології. Крім того, М. РНК було показано провести детермінанти адаптації господаря  і подолання опору рослини-хазяїна, а також патогенних отриманих  опору в томатному і тютюну. За відсутності системи зворотного генетики, доповнення досліджень і  генетичних досліджень рекомбінації, такі як згадані вище пропозиції альтернативних підходів для вивчення структурно-функціональних взаємовідносин різних генів впуть.

 

 

 

Малюнок 11 генетичної рекомбінації в  якості інструменту для функціонального  аналізу плямистого зів'янення томатів