Вірус плямистого в"янення томатів

У цьому схопивши кришку Дисертація була вивчена в пробірці, що дозволяє подальшої маніпуляції послідовностей кришка донорів. Спостереження, що глобіну  мРНК з dynucleotide послідовність додаток  до вірусної шаблон і навіть обмежений  стенограми нагадують вірусні мРНК N, з 14-NT доповнюють один одного, були використані  в якості кришки донорів \ відзначив, що взаємодія між донором і шаблон не може бути обмежене однієї пари підстав. Це не відомо, однак, в якій мірі фактична база спаровування між цими додатковими залишків фізично відбувається.

Той факт, що кращими субстратами  для кришки вихопивши є донорами з більше ділянці додаткових припускає, що ступінь додаткових відіграє певну роль у виборі кришки донорів. У пробірці аналіз кришка вимог донорів для ендонуклеази грипу показали, що сайт ендонуклеази розщеплення визначається тільки послідовність донорів кришку і не вимагає спарювання підстав взаємодії з вірусною шаблону.

Тільки після розщеплення є спарювання підстав взаємодій, необхідних для правильного позиціонування відколу лідером на вірусні шаблон для належного грунтування транскрипції (Хаген і ін., 1995). З подовженням буде вкрай неефективним на тетрануклеотидом доповнюють шаблон 3'-кінця, ступеня додатковою відколу грунтовки і вірусних шаблон мабуть, обмежена до 3 пар основ (Honda і ін., 1986). Крім того, кришка донорів з трьох нуклеотидів (AGC) на додаток до вірусної шаблону відколу виключно після другий додатковий вирахування (Chung та ін, 1994;. Хаген та ін, 1995;. Рао та ін, 2003.). Спостереження, що кришка донорів з довгим (14 NT) ділянці доповнюють шаблон впуть здається, відколів виключно після першої і, можливо, другого спарювання підстав залишок у відповідності з цими висновками.

Однак, якщо сайт розщеплення  вибір для впуть заснований на нуклеотидних особистість тільки й залишається загадковою, чому донорів з великою відрізок додаткових кращий для тих, хто тільки один або два додаткові відрахувань. Ці спостереження, здається, вказують на механізм відбору для впуть, в якому, на відміну від того, що повідомлялося на вірус грипу, спарювання підстав взаємодії з шаблону беруть участь на стадії дроблення вибору сайтів, оскільки це було б лише відмінності, на яких спостерігається перевага може бути заснований. Таким чином, модель, запропоновану Duijsings та ін. (2001) може бути розширена за рахунок включення окремих крок лідера відбору до реакції розщеплення ендонуклеаз, як показано (рис. 6).

Малюнку 6: модель, в якій ковпачок вихопивши з впуть починається з вибору кришка донорів кроком.

Вибір кришки донора, або мРНК хоста або вірусної мРНК, заснований на ступені доповнюють вірусних шаблону. Як зазначено у відповідних розмірів верхньої безліч спрямований вниз стрілками, вірусні мРНК є кращим субстратом для виробництва та подальшого використання праймерів для ініціації транскрипції. Вибір кришки донорів на базі пару з вірусної РНК шаблон може відбуватися або на вибір або, по крайней розщеплення крок, або обох.

Дослідження вірусної мРНК в пробірці раніше спостерігалося для вірусу грипу (Пен і ін., 1996). Поява дослідження в природних умовах було визнано малоймовірним, тому що це привело б не чистий синтез вірусної мРНК, яка несумісна з ефективного розмноження вірусу. Для вірусу грипу вірусної полімерази був знайдений вибірково захистити вірусної мРНК від повторного схопив у пробірці (Ши і Коло, 1996). Було показано, що пул вільних, не пов'язаних RNP-полімерази існує в ядрах інфікованих клітин (Детжен та ін., 1987), які могли б служити меті мРНК захисту, так як вони тільки потребують захисту, поки вони не вивозити з ядра. Зауважень, які впуть мРНК не тільки знову схопив але насправді є бажаними мета вірусних ендонуклеази в пробірці, підкреслив, що для впуть теж механізм захисту мабуть існувати. Механізм за участю захисту від вірусної полімерази не представляється можливим так як впуть відтворює в цитоплазмі і такий захист передбачає синтез додаткового білка полімерази для кожної мРНК синтезовані. Вірусні мРНК можна відрізнити від клітинних мРНК наявністю зберігаються 8 вірусних залишків безпосередньо після обмежений послідовність лідера, і структура 3'-кінці шпильки. Жодна з цих функцій, однак, може запобігти повторному схопивши в пробірці. Цікаво, що це, здається, має на увазі, що зароджується вірусної мРНК повинен бути захищений від повторного вихопивши, як тільки його обмежений 5'-кінці виходить з розшифровки полімерази.

2,8 впуть термінації  транскрипції

Той факт, що термінації транскрипції впуть S-сегмента мРНК відбувається в  кінці міжгенних шпильки припускає, що механізм припинення цих мРНК заснована на вторинної структури в зародження стенограми. Messenger РНК Tacaribe ареновірус також володіють такими шпильки 3'-кінці структур і вважається, що ці структури представляють собою фактичний сигнал припинення, в тому ж порядку, як прокаріотичних припинення транскрипції відбувається (Iapalucci та ін., 1991). Такий механізм припинення є повністю сумісний з моделлю ролі N (або П.) як antiterminator.

Зароджується мРНК стенограма не encapsidated по N, і в результаті шпильки  структура може бути утворена, як тільки ця послідовність розшифровані. Це може згодом призвести до термінації транскрипції. Зароджується геному копію, з іншого боку, encapsidated п, імовірно спільно з кінця 5 '. Як результат, шпильки послідовність буде encapsidated по транскрипції, запобігаючи утворенню шпильки структури. Отже, реплікативної транскрипції не припиняється і подальшого readthrough від шпильки послідовність дозволяє синтезувати копію геному у всю довжину.

Крім того, припинення було запропоновано, щоб бути результатом  шпильок на вірусної РНК шаблону. Однак, шаблон encapsidated білком N, в дуже сильній білок-РНК обов'язкового взаємодії, яке запобігає вторинне утворення структури.

Прив'язка експерименти з N білка  з Bunyamwera Orthobunyavirus, хантавірусна Sin Nombre і  впуть вказати це зв'язування може тільки бути порушена в NaCl концентрації (набагато) більше ніж на 300 мм (Osborne & Elliott, 2000;. Річмонд та ін, 1998; Світ & Панганібан, 2004). Крім того, в той час як полімеразна втрачається від комплексів РНП від CsCl градієнтного центрифугування, зв'язування N білка з РНК залишається незмінним у цих умовах.

Крім того, в цій гіпотезі присутності шпильки у вірусній шаблон вважається непереборною блок для вірусної полімерази, що може призвести  до припинення транскрипції. Припинення цього механізму, таким чином, виникають  перед шпилькою послідовності, а  результати представлені в розділі 4 показують, розірвання договору відбувається в кінці шпильки послідовності.

Сегменті M РНК впуть, як і  сегмент S РНК, має міжгенних послідовність  шпильки, і тому найбільш імовірно, що M-сегмент транскрипції закінчується так само, як у S-сегмента. Сегмента L РНК повністю негативному сенсі  кодування і недоліки міжгенних  регіоні. Складні передбачення нетрансльованій  області (УТР) після стоп-кодону L-гена вказують на потенційні формування структури  шпильки. Хоча кілька складних моделей  можливі, особливо структури стовбурових  петлі присутня у всіх прогнозів. Тому, цілком можливо, що припинення L мРНК також викликані шпильок в  зародження стенограми. Крім того, вона не може бути виключено, що припинення для L відбувається по-іншому, або, що L мРНК не менше, ніж L геному сегментів.

2,9 ініціації трансляції  вірусної мРНК

Як і багато вірусних мРНК, впуть мРНК не поліаденільованим  але замість цього має певною структурою 3'-кінці. Це 3'-кінці шпильки  можуть функціонально замінити полі (А) хвоста в circularisation мРНК для ефективного  перекладу. Функціональна заміна полі (А) комплекс хвіст PABP повідомляється на Вірус тютюнової мозаїки (ВТМ), вірусу мозаїки люцерни (AMV), ріпа вірусу мозаїки (TuMV), томатний густі вірусу трюк (TBSV), ріпа жовтого вірусу мозаїки ( TYMV) і  тютюн некроз вірусу (ТНВ), вся рослина  зараженні РНК-вмісних вірусів (Галлі, 1998; Галлі і Кобаясі, 1994; Neeleman и  др., 2001;. Леонард і ін, 2004;. Фабіан і Білий, 2004; Мацуда і Дреєр, 2004 року; Meulewaeter та ін, 2004) ..

Для Географічна негативні  мілину РНК-вмісних вірусів не так  багато відомо про переведення вірусної мРНК. мРНК вірусу грипу як обмежений  і поліаденільованим, ще вірусної мРНК переважно переведена в той час  як стільникові синтезу білка  вниз регулюється.

Вірус грипу NS1 білок бере участь у протидії анти-вірусних інтерферону  господаря (ІФН) відповідь і супресорів РНК глушників (Бергман та ін, 2000;. Talon та ін, 2000;. Ванг та ін, 2000;. Круга та ін др., 2003;. Delgadillo та ін, 2004;. Bucher та ін, 2004;. Лі та ін, 2004;.). Крім того, NS1 діє як вірусні  мРНК Enhancer переказ через обов'язковий  як PABP і eIF4G (De La Luna та ін, 1995;. Маріон та ін, 1997;. Сальваторе та ін, 2002;. Цю & Krug 1994 року; Чена. , 1999; Арагон та ін, 2000; .. Burgui та ін, 2003), із зазначенням NS1, можливо, 3'-5 'наведення  мостів схожі на PABP.

3'-кінець шпильки або  зберігається мотив послідовність  мРНК впуть, як полі (А) хвоста  заміни, може бути сайт впізнавання  для передбачуваної вірусної Enhancer перекладу. Як грипу NS1 білок,  НЗ білків тваринного зараження  буньявірусов беруть участь у  протидії анти-вірусних інтерферону  господаря (ІФН) відповідь (Bouloy и др., 2001;. Вебер та ін, 2002;. Коль  і ін, 2003.). Крім того, впуть АПЛ  було показано, що супресор РНК  глушників (Bucher и др., 2003;. Такеда  і ін, 2002.). Крім того, кілька bunyaviral білків АПЛ були виявлені пов'язані  з полісом фракцій або 40S рибосомної  субодиниці (Di Боніто та ін, 1999;. Саймонс  та ін, 1992;. Watkins & Jones 1993), маючи на  увазі необхідність участі НЗ  в перекладі. Тому, як вірус  грипу NS1 і на додаток до  придушення мовчання генів, білків  впуть НЗ можуть також відігравати  певну роль у перекладі, можливо,  діючи як вірусний функціонал  гомолог PABP.

2,10 методи дослідження  транскрипції та реплікації негативних  вірусів пасмо

Молекулярні дослідження  транскрипції та реплікації негативних вірусів нитка вже давно заважає  той факт, що, на відміну від позитивних вірусів пасмо, зворотний підходи  генетики (тобто відновлення життєздатною, тиражування геномів від повної довжини, клонованих копій ДНК), не можуть бути безпосередньо застосовані  у зв'язку з геномів бути негативною полярності.

Початок геному цикл посилення  вимагає (правильно зібраний) RNPs, або  відновлені в клітинах (в пробірці), надаючи всі необхідні компоненти, або відновленої в пробірці з  використанням очищених рекомбінантних білків або очищеного вірусу. На початку проекту, описаного в  даній роботі, в природних умовах відновлення сегментованих негативні  вірусів нитки, що дозволяють зворотному підходи генетики, нещодавно були розроблені (див. огляд в: .. Палезе та ін, 1996; Pekosz та ін, 1999; Rose, 1996 ). Ці перші  системи були засновані на інфекції культивованих клітин з рекомбінантний вірус віспи (vvT7), щоб отримати вираз  бактеріофага Т7 РНК-полімерази. За котрансфекцію  цих клітин плазмідами, що містять  Т7 промотора керовані гени вірусного RdRp та N білків, а також плазміди, що несе моделі шаблон РНК (зазвичай репортер гена в оточенні вірусних геномних послідовностей терміналу), функціональні RNPs були відновленого , які можуть легко  брати участь в транскрипції і / або  реплікації. Недоліком цих систем є те, що всі цитоплазматичної РНК  увінчані вірус коров'ячої віспи  укупорки ферменту. У результаті, знову (Т7) транскрибуються РНК обмежений  і може бути переведена безпосередньо, що утруднює виявлення справжніх  вірусної транскрипції. Крім того, клітини  можуть бути вивчені тільки протягом обмеженого періоду часу з-за цитопатогенну  дію (CPE), інфекції вірусу віспи.

У одночасних над докторською  дисертацією, аналогічні системи в  природних умовах відновлення був  розроблений для вивчення впуть  реплікації і транскрипції (Duijsings, 2001). Активний RNP комплекси були успішно  відтворена в культурі клітин мишачого, вимірюваний репортер гена (люциферази) діяльності. Однак, у зв'язку з закупорювання  вірусу вакцини укупорки ферменту, не проводиться розходження можуть бути між replicational і транскрипционной активності. У той же час, для phlebovirus Uukuniemi (UUKV) більш елегантний Поль Я - Pol II система була розроблена в якій працює ссавців промоутерів для РНК-полімерази I (Pol I) і РНК-полімерази II (Пол II), що виключає необхідність для вірусу віспи інфекції і таким чином уникнути вірусу коров'ячої віспи викликаної CPE (Флік і ін., 2001).

Крім того, в пробірці тести  можуть бути використані для вивчення молекулярних деталі розмноження вірусу. У цих дослідженнях частинок вірусу, очищають від заражених хостів, стимулюються для виконання транскрипції та / або реплікації в пробірці шляхом створення відповідних умов реакції. У пробірці тести дали багато інформації про механізми транскрипції та реплікації сегментованих негативні нитки  РНК-вмісних вірусів (Беллока ін, 1987;. Беллока & Kolakofsky, 1987;. Гарсен та ін, 1992; Нгуєн та ін, 1997;. Vialat та ін . ін, 1992), зокрема, вірус грипу А (Нагато та ін, 1989;. Пена та ін, 1996;. Шапіро та Коло, 1988; Ши та ін, 1995;. Skorko та ін, 1991;. Тойода та ін. , 1994).

Перевага цих аналізів є висока маніпуляції: багато компонентів  реакції знаходяться під прямим контролем, і можуть бути додані або  опущений досхочу.

2,11 синтезу РНК у відсутність  ретикулоцитів лізат

Для першого аналізу продукту в пробірці синтезованих РНК, очищена  впуть инкубировали в присутності  НТП (в тому числі мічені CTP) в умовах, як повідомляє Едкінс та ін. (1995). РНК  виробництва було використано як зонд для екрану Нозерн, що містить  всі впуть геному сегментів (рис. 7) і результати показали, що молекули РНК специфічні для всіх трьох  сегментів були синтезовані.

Малюнок 7: Нозерн-аналіз з  використанням у пробірці синтезованих

РНК як зонд.

Для того, щоб визначити  характер синтезованих молекул РНК, в пробірці продуктів реакції  з декількох незалежних експериментах  були вирішені РНК-гель-електрофорезу. Результати цього аналізу показали, послідовно основні різних продуктів  приблизно як повідомлялося раніше аль Едкінс та ін. (1995), який був відсутній  з-під контролю реакції. 3 кб продукт  гібридизації з пасмо конкретних зонд для VC-сенсі S РНК), і comigrated з вірусної РНК ізольовані від впуть-інфікованих Nicotiana Rustica (рис. 8) або очищені віріонів. Це показує, що 3 кб РНК група представлена ​​повна довжина S РНК, мабуть синтезованих в результаті реплікації.