Теоретическое обоснование совершенствования промышленно-ценных свойств стартовых культур и их практическое применение в технологии мя

Рис. 8. Хроматограмма органических кислот, полученных в результате катаболизма метионина штаммом Lactobacillus plantarum 7К

 

При определении органических кислот были получены пики α-кетоглутаровой кислоты (т.к. исследуемые образцы  были с добавлением α-кетоглутарата), молочной, щавелевой, лимонной, фумаровой кислот, а также обнаружены пики неидентифицированных соединений. Микроорганизмы других видов могут конвертировать аминокислоты с образованием разнообразных соединений, в том числе и органических кислот, таких как лимонная, пировиноградная, янтарная, молочная, уксусная, пропионовая, масляная и др. Выбор ароматобразующих штаммов, а также создание определенных консорциумов позволит формировать желаемый вкус и аромат ферментированных мясопродуктов.

 

Определение способности стартовых культур инактивировать активные формы кислорода и связывать ионы металлов переменной валентности

 

Для современных прокариотов O₂, содержащийся в окружающей среде, в ряде случаев является абсолютно необходимым. В то же время кислород и его производные (супероксид анион радикал кислорода О , пероксид водорода Н₂О₂, синглетный кислород ¹О₂, гидроксильный радикал НО^•) являются токсичными для микробных клеток.  Отсутствие или сбой системы равновесия между образованием производных форм кислорода и их дезактивацией антиоксидантами приводит к возникновению окислительного стресса. Изучение вопроса взаимодействия стартовых культур с кислородом и его формами позволит отобрать штаммы, способные выживать в условиях окислительного стресса. Направленное использование стартовых культур, обладающих механизмами инактивации производных кислорода, позволит снизить их количество в мясных продуктах и, тем самым, замедлить окислительную порчу.

Ионы металлов переменной валентности (Fe²⁺, Cu⁺, Mo³⁺ и др.) являются необходимыми кофакторами огромного количества ферментов в живых организмах с одной стороны, но представляют опасность для клеток, с другой стороны, т.к. их присутствие усиливает образование высокореакционных гидроксильного и алкосильного радикалов. Хелатные соединения являются важными компонентами антиоксидантной защиты организмов за счет того, что связывают ионы металлов переменной валентности и, тем самым, препятствуют их вовлечению в реакции разложения перекисей. В связи с этим у стартовых культур была определена способность ингибировать автоокисление L-аскорбиновой кислоты, пероксидазная, каталазная и супероксиддисмутазная активности, а также способность связывать ионы металлов Fe²⁺ и Сu²⁺ (табл. 5).

Таблица 5

Способность стартовых  культур инактивировать активные формы кислорода и связывать ионы металлов переменной валентности

Микроорганизмы	Ингибирование автоокисления  аскорбиновой кислоты/мг белка, %	Количество связанных ионов Fe2+,  мкг/мг белка	Количество связанных ионов Сu2+, нмоль/мг белка	Ед. активности СОД/мг белка
L. plantarum  22/2	5,0	85,89	28,94	5,31
L. plantarum 2П	9,4	122,05	40,42	6,81
L. plantarum 31	5,5	81,24	27,17	15,30
L. plantarum 32	12,1	162,47	54,78	5,94
L. plantarum 7К	4,3	94,34	31,13	2,42
L. plantarum 21	12,9	172,75	58,35	5,12
L. plantarum 100	9,5	172,92	–	–
L. plantarum 19	13,3	117,78	38,64	3,61
L. sakei 45	13,9	208,57	70,57	–
L. sakei 105	17,4	291,83	99,31	5,77
L. sakei 104	13,6	292,28	98,33	5,79
L. sakei 35	9,8	219,45	73,28	8,42
L. sakei 101	5,2	88,84	29,37	–
L. sakei 103	10,7	119,85	39,75	–
L. casei 10	21,5	157,46	53,44	4,68
L. curvatus 301-1	14,0	–	–	4,51
L. curvatus 1	8,8	195,01	64,93	3,41
L. curvatus 2	14,8	292,08	96,65	–
L. curvatus 102	8,43	312,55	104,04	7,63
P. acidilactici 8	16,9	172,66	58,35	СОД АКТИВНОСТЬ НЕ ОБНАРУЖЕНА
P. acidilactici 15	4,4	262,54	–
P. acidilactici 25	10,6	154,75	–
P. acidilactici 3	5,6	122,28	41,25
P. acidilactici 33	11,7	265,09	89,09
P. acidilactici 34	18,2	244,61	81,92
P. acidilactici 38	1,6	145,72	48,81
P. acidilactici 27	29,0	325,87	109,78
P. pentosaceus 23	16,3	198,65	66,62
P. pentosaceus 28	6,8	139,24	46,38
P. pentosaceus 31	10,6	138,73	46,75
P. pentosaceus 39	15,0	194,67	65,40
P. pentosaceus 55	1,63	97,85	32,72
P. claussenii 9	7,1	101,23	33,86
S. carnosus 108	8,5	125,85	42,49	4,45
S. xylosus 45	1,8	102,52	33,86	6,65
S. carnosus SAL-1	6,0	–	–	2,76
S. carnosus 96-2	2,5	83,81	28,26	5,05
S. carnosus 111-2	2,0	127,14	43,13	2,16
S. carnosus 301-2	7,4	71,77	23,52	3,73

Обозначения: «–» –  показатель не определялся

Качественная оценка каталазной активности всех исследуемых  микроорганизмов была проведена  при их идентификации. Каталазная активность была обнаружена только у стафилококков. Штаммы мало отличались между собой по каталазной активности, минимальная активность была у S. carnosus SAL-1 – 26 ед/мг, максимальная – у S. xylosus 45 – 36 ед/мг. Каталазная активность составила для S. carnosus 111-2 – 30 ед/мг,                       S. carnosus 108 – 35 ед/мг, S. carnosus 96-2 – 31,5 ед/мг, S. carnosus 301-2 – 33 ед/мг. Стафилококки также показали пероксидазную активность при тестировании с помощью бензидинового теста.

Анализируя полученные результаты по всем изученным активностям, связанным с защитой от окислительного стресса, нужно отметить, что в большинстве случаев недостаток активности одной ферментативной системы компенсируется наличием другой. Итак, для использования в промышленности штамм-продуцент должен синтезировать нужные метаболиты в необходимом количестве, обуславливающие промышленную ценность (технологичность) стартовых культур.

 

ГЛАВА 7. Применение денитрифицирующих микроорганизмов  в мясной промышленности

 

Нитрит натрия является мультифункциональной пищевой добавкой – в результате посола мяса он и  его производные оказывают влияние на аромат, задерживают окислительную порчу жиров, участвуют в образовании окраски продукта и предотвращении развития микробиологической порчи. Вместе с тем, даже при наличии всех благоприятных условий среды, значительная часть внесенного нитрита натрия, до 40%, остается неиспользованной и обнаруживается в продуктах (Лисицын А.Б., 2005). Остаточный нитрит натрия служит источником образования токсичных нитрозосоединений.

Один из путей снижения остаточного  нитрита натрия – введение в фарш денитрифицирующих бактерий, которые, наряду с обычной дыхательной системой, имеют специфическую окислительно-восстановительную систему.

Однако применяемые  в настоящее время денитрифицирующие  микроорганизмы не обеспечивают синтеза  достаточного количество фермента нитритредуктазы, позволяющего значительно снижать или полностью исключать наличие остаточного нитрита в мясных продуктах. В связи с этим было решено повысить уровень синтеза фермента нитритредуктазы с помощью генной инженерии. Для получения продуцента нитритредуктазы использовали штамм S. carnosus 108 (B-8953), который входит в коллекцию стартовых культур МГУПБ.

С генетической точки  зрения за проявление нитритредуктазной  активности в                    S. carnosus отвечают шесть генов: nirC, nirR, sirA, nirB, nirD, sirB, из которых пять последних сгруппированы в оперон (рис. 9) (Neubauer Н., 1999).

Рис. 9. Карта локуса, включающего  гены, участвующие в восстановлении нитрита

 

Ген nirC не активен и является остатком гена-транспортера. В анаэробных условиях транскрипция инициируется с промотора гена nirR, а в аэробных – с промотора гена sirA.

Первоначально была проверена  целесообразность замещения промотора  нитритредуктазного оперона для  увеличения активности штамма. В связи  с противоречивыми данными о роли белкового продукта гена nirR было решено проводить замену промоторов генов nirR и sirА. Для усиления транскрипции оперона был выбран хорошо изученный промотор гена ксилозоизомеразы xylA из S. xylosus c геном белка-регулятора xylR или без него. Это связано с возможной токсичностью для клетки сверхэкспрессируемого белка. Быстрый отбор трансформантов осуществлялся за счет использования в качестве селективного маркера гена устойчивости к эритромицину Em из транспозона Tn917. Замена промотора осуществлялась с помощью термочувствительной плазмиды, используя двойной кроссинговер при длине флангов для интеграции 750–960 п.н. (рис. 10).

Рис. 10. Схема конструирования  плазмиды pBT-thyA-gap-nirR, интегрируемой в хромосому Staphylococcus carnosus

 

Для того чтобы организм не имел статуса «генетически модифицированного», допускается введение только собственного генетического материала. Поэтому в качестве генетического маркера была выбрана мутация по гену тимидилат синтетазы thyA, которая возникает спонтанно в гене thyA. Данный генетический маркер детерминирует отчетливо выраженный фенотипический признак – не способность штамма расти без тимидина, и является допустимым при генетической модификации штаммов, применяемых в пищевом производстве (Sasaki Y., 2004). После изучения нитритредуктазной активности трансформантов, в наиболее «удачной» конструкции селективный маркер Em замещен геном тимидилат синтетазы thyA, а промотор гена xylA сильным промотором гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы gap из S. carnosus с помощью созданной плазмиды pBT-thyA-gap-nirR (рис. 11).

Штамм, полученный с помощью вектора  pBT-thyA-gap-nirR, был назван S. carnosus LIA-96 (В-9518). Двенадцатичасовое микроаэрофильное культивирование полученного рекомбинантного штамма S. carnosus LIA-96 в L-среде с исходной концентрацией нитрита натрия, равной 25 мг на 100 мл, привело к снижению концентрации нитрита натрия до нулевого уровня, в то время как исходный штамм S. carnosus B-8953 восстановил только 50% нитрита. Таким образом, показано значительное усиление синтеза фермента нитритредуктазы в рекомбинантном штамме.

                          

                       а)                                                                            б)

Рис. 11. а) Замена промоторной области гена nirR с помощью плазмиды                          pBT-thyA-gap-nirR и б) Электрофорез ПЦР продукта с хромосомы S. carnosus, трансформированного pBT-thyA-gap-nirR

Обозначение: 1 – ПЦР  фрагмент 3250 п.н., M – маркер молекулярного веса GeneRuler 1 kb

 

Клинические исследования штамма S. carnosus LIA-96 in vivo проводились на белых линейных мышах массой (12±1) г. При определении острой и хронической токсичности микроорганизм вводился per os в течение 7 и 30 сут (вводимая доза 3×10³ КОЕ/0,5 мл). Гистология внутренних органов (миокарда, тимуса, легких, печени, селезенки, почек, кишечника, желудка, корня языка, головного мозга) проводилась на 1 и 7 сут после прекращения введения штамма. Были исследованы 4 группы животных (по 10 мышей в каждой): 1 – подопытная (вводились живые клетки), 2 – подопытная (инактивированные клетки), 3 – контрольная (физраствор) и 4 – интактная. Проведенные исследования показали, что пероральное введение суточной живой культуры штамма Staphylococcus carnosus LIA-96 не приводит к развитию во внутренних органах и ЦНС мышей изменений, указывающих на наличие токсического действия.

При изучении вирулентности, общей токсичности и токсигенности  вводили внутрибрюшинно (10⁶, 10⁷ и 10⁸ КОЕ/0,5 мл) суспензию живых клеток, инактивированных клеток и культуральную среду, освобожденную от клеток центрифугированием, соответственно. Наблюдение за изменением поведения, внешнего вида и веса животных осуществляли в течение 5 сут. Сравнение проводилось с интактными и контрольными животными. В результате проведенных исследований штамм Staphylococcus carnosus LIA-96 признан безопасным по показателям безвредности, токсичности, токсигенности и вирулентности.

Молекулярно-генетическая экспертиза установила, что штамм S. carnosus LIA-96 не является генетически модифицированным, так как был получен путем перестройки собственного генетического материала без включения в его состав чужеродной ДНК. Показана фенотипическая и генотипическая стабильность данного штамма. Проведено молекулярно-генетическое исследование, подтверждающее отсутствие в геноме штамма S. carnosus LIA-96 генов (sea, seb, sec, sed, see, eta, etb, tst), кодирующих белки-токсины.

Глава 8. Перспективы  использования микроорганизмов  в мясной промышленности: генетическая модификация штаммов-продуцентов  в желаемом направлении

 

Для создания штаммов  с желаемым генотипом наиболее эффективным современным методом на сегодняшний день является способ введения в микробные клетки определенных генов, полученных с использованием технологий рекомбинантных ДНК. Штаммы можно конструировать как в направлении изменения метаболизма, так и в направлении их приспособления к особым требованиям технологического процесса.