Теоретическое обоснование совершенствования промышленно-ценных свойств стартовых культур и их практическое применение в технологии мя

Предложены пути предотвращения распространения детерминантов антибиотикоустойчивости промышленными микроорганизмами.

Предложен подход к изучению и отбору непатогенных стартовых культур  энтерококков.

Разработаны экспресс-методы отбора штаммов с аминоксидазной активностью, ароматобразующих штаммов с глутаматдегидрогеназной и трансаминазной активностью с помощью ТСХ.

Создана программа с базой данных основных функциональных свойств микроорганизмов, входящих в коллекцию МГУПБ, позволяющая  проектировать состав бактериальных препаратов комплексной направленности для мясных продуктов.

Проведена паспортизация промышленно-ценных штаммов с помощью ДНК-фингерпринта (геномной дактилоскопии) методом ПЦР  с использованием штаммоспецифических  праймеров. Проведено депонирование штаммов стартовых культур в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика, ряд штаммов поставлен на национальное патентное депонирование.

На основе природных штаммов  разработаны бактериальные препараты: «Лактомикс», предназначенный для  биотрансформации мясного сырья  и производства ферментированных мясопродуктов; «Аромалакт» – для цвето- и ароматообразования ферментированных мясопродуктов и биотрансформированного мясного сырья; «Биосейф» – для снижения уровня биогенных аминов в ферментированных мясопродуктах и биотрансформированном мясном сырье, ТУ 9229-045-02068640-07; «Дебарс плюс» – для производства ферментированных мясных изделий, ТУ 9229-046-02068640-07.

На основе штамма S. carnosus LIA-96 разработан бактериальный препарат «Биоцвет», предназначенный для производства термически обработанных предварительно ферментированных мясных изделий, ТУ 9229-047-02068640-07 (на стадии согласования с органами Роспотребнадзора по договору № С-77НЛ/06 от 18.12.2006 г.).

Молекулярно-генетическая экспертиза, проведенная ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, установила, что штамм S. carnosus LIA-96 не является генетически модифицированным, так как был получен путем перестройки собственного генетического материала без включения в его состав чужеродной ДНК. Показана фенотипическая и генотипическая стабильность данного штамма. Проведено молекулярно-генетическое исследование, подтверждающее отсутствие в геноме штамма S. carnosus LIA-96 генов, кодирующих белки-токсины.

Проведены клинические исследования штамма S. carnosus LIA-96 in vivo на белых линейных мышах, в результате которых штамм признан безопасным по показателям безвредности, токсичности, токсигенности и вирулентности.

Разработаны рецептуры  и технологии новых видов комбинированных  и традиционных мясопродуктов: Мясные продукты в форме первого сорта с добавлением биотрансформированного легкого, ТУ 9213-002-51611136-03, Паштеты в оболочке с добавлением биотрансформированной селезенки, ТУ 9213-002-00423769-03, Полуфабрикаты мясные рубленые с бактериальным препаратом «Лактомикс», ТУ            9214-350-23476484-08, Колбасы сырокопченые, ТУ 9213-007-224-68-005-08, Колбасы сыровяленые, ТУ 9213-008-224-68-005-08, Продукты из свинины деликатесные, ТУ              9213-007-02068315-08. Промышленная апробация разработанных технологий проводилась в условиях Черкизовского МПЗ, ЗАО «Микояновский мясокомбинат», ОАО «Царицыно», ООО МПЗ «Рублевский», ОАО «ИКМА», ООО «АНСЕЙ ВМК», Ростовского и Новочеркасского мясокомбинатов, ЗАО «Агрофирма «Мясо», ООО «Гиперглобус».

Результаты работы нашли  применение в учебном процессе МГУПБ на кафедре «Технология мяса и мясопродуктов», при проведении специализации инженеров-технологов мясной промышленности, при выполнении дипломных и диссертационных работ. Новизна решений защищена патентами, справками о депонировании стартовых культур в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика. Практическая значимость работы подтверждена соответствующими документами.

Апробация работы. В диссертации обобщены результаты исследований, проведенных лично автором, при его непосредственном участии и под его руководством.

Основные результаты работы были предметом докладов и обсуждений на Международных и Российских научных конференциях, семинарах: «Проблемы экологической безопасности Северо-Кавказского региона», Ставрополь, 2000; «Пищевой белок и экология», Москва, 2000; «Экологические, технологические и экономические аспекты производства продуктов питания», Семипалатинск, 2000; «Пища, экология, человек», Москва, 2001; «Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования», Москва, 2002; «Технологические аспекты комплексной переработки сельскохозяйственного сырья при производстве экологически безопасных пищевых продуктов общего и специального назначения», Углич, 2002; «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2002, 2003, 2005, 2007, 2008; «Живые системы и биологическая безопасность населения», Москва, 2002; «Современные технологии переработки животноводческого сырья в обеспечении здорового питания: наука, образование и производство», «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», Москва, 2004; «Значение биотехнологии для здорового питания и решения медико-социальных проблем», Калининград, 2005; «Живые системы и биологическая безопасность населения», Москва, 2005; Выездной пленум НОГР клинико-патогенические аспекты желудочно-кишечного дисбиоза при заболеваниях органов пищеварения: диагностика, лечение и профилактика, 2005; Биология наука XXI века: 10-я Пущинская школа-конференция молодых ученых, посвященная 50-летию Пущинского научного центра РАН, Пущино, 2006; «Успехи медицинской микологии», 2006; «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», Москва, 2006; «Живые биосистемы 2007», Москва, 2007.

Результаты работы удостоены  дипломами, грамотами и медалями конференций «Биотехнология: состояние  и перспективы развития», «Биотехнология. Вода и пищевые продукты», «Биотехнология и медицина», «Технологии живых  систем», «Живые системы и биологическая безопасность населения», биотехнологической выставки-ярмарки «РосБиоТех-2007». Исследования выполнялись в рамках научных тематик МГУПБ, их результаты регулярно рассматривались на научно-техническом и ученом советах. По материалам диссертации опубликовано: 101 работа (в т.ч. статей в журналах, рекомендованных ВАК – 17, в других изданиях – 37); монография, патенты, два лабораторных практикума и методические указания для студентов специальностей 270900, 250301, 240901, 240902 и магистров направления 260100.

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает введение, 9 глав, выводы и приложения, изложена на 363 страницах основного текста, содержит 76 таблиц и 133 рисунка. Список литературы состоит из 288 источников.

На защиту выносятся  следующие основные положения:

- научные принципы совершенствования  свойств стартовых культур, основанные  на внутренней перестройке генома  клеток и создании условий,  побуждающих включение генов  в жизнедеятельность клетки;

- системный подход к направленному  отбору и идентификации стартовых культур;

- обоснование необходимости определения  устойчивости к антибиотикам  промышленных микроорганизмов и  выбора штаммов, свободных от  мобильных генетических факторов  устойчивости;

- результаты исследований ферментативных  активностей микроорганизмов, влияющих на цвето-, ароматообразование, снижение уровня биогенных аминов, замедление окислительной порчи липидов мясного сырья, подавление жизнедеятельности санитарно-показательной микрофлоры за счет синтеза бактериоцинов, и их взаимосвязь с генетическими детерминантами;

- способ конструирования штамма  суперпродуцента фермента нитритредуктазы  путем перестройки собственного  генетического материала, позволяющего  значительно снижать или полностью  исключать наличие остаточного  нитрита натрия в мясных продуктах;

- обоснование принципов подбора  промышленно-ценных штаммов, обладающих  взаимной совместимостью, при использовании  компьютерной программы с базой  данных функциональных свойств  стартовых культур в методологии  создания функциональных бактериальных препаратов;

- биотехнология ферментированных  мясных продуктов, в том числе  с использованием нетрадиционного  сельскохозяйственного сырья;

- оценка эффективности влияния  разработанных бактериальных препаратов  на качественные показатели и  безопасность мясного сырья и готовых мясных продуктов.

 

СОДЕРЖАНИЕ  РАБОТЫ

 

Во введении кратко изложено состояние проблемы на данный период времени, обоснована актуальность выбранного направления, поставлена цель, определены задачи исследований и сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну, показана практическая значимость и степень апробации работы.

В первой главе «Литературный  обзор» приводится обзор информации относительно роли микроорганизмов в современной биотехнологии мясных продуктов.

В главе 2 «Методика  постановки эксперимента и частные  методы исследований» даны краткие характеристики объектов исследований, представлена схема эксперимента (рис. 1), обоснован комплекс исследуемых показателей и изложены методики их определения.

Объектами исследований служили спонтанно  ферментированные мясные продукты, молочнокислые  бактерии видов Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus claussenii, денитрифицирующие кокки Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Macrococcus caseolyticus, энтерококки Enterococcus faecalis, дрожжи Debaryomyces vanriji, Debaryomyces polymorphus, Debaryomyces hansenii, Candida famata, мицелиальные грибы Penicillium camembertii из коллекции стартовых культур МГУПБ. Штамм-суперпродуцент фермента нитритредуктазы Staphylococcus carnosus LIA-96 (В-9518).

Штамм Micrococcus sp. В-3087, обладающий гистидиндекарбоксилазной активностью, типовые штаммы P. pentosaceus В-7511, P acidilactici В-7509, L. plantarum В-6758 и D. hansenii Y-1682, тест-культуры патогенных и условно-патогенных штаммов Salmonella typhymurium LT2 (B-3533), Proteus vulgaris ATCC 13315 (B-1667), E. coli K-12 C 600 (B-1010), Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P (В-6646), S. epidermidis B-8933,     S. epidermidis В-8940, E. faecalis В-4610, Staphylococcus aureus subsp. aureus 6538Р, Staphylococcus epidermidis 14990, Staphylococcus saprophiticus 15305, Escherichia coli 157, Salmonella typhimurium 5715, Shigella sonnae 5063, Proteus vulgaris 14, Proteus mirabilis 47 были предоставлены ВКПМ ГосНИИгенетики и ГКПМ ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Стартовые культуры, входящие в состав бактериальных препаратов фирм WIBERG/Австрия, Gewürzmüller/Германия, Chr.Hansen/Дания, Texel/Франция. Бактериальные препараты «Лактомикс», «Аромалакт», «Биосейф», «Биоцвет», «Дебарс плюс», модельные мясные системы и вновь разработанные мясные продукты.

В процессе лабораторных исследований и опытно-промышленных выработок были использованы классические микробиологические, физиолого-биохимические, молекулярно-генетические, физико-химические, органолептические методы, их модификация, а также вновь разработанные методы. Генетические методы, используемые в работе (выделение плазмиды из грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, выделение хромосомной ДНК, электропорация, блоттинг по Саузерну, гибридизация по Саузерну, лигирование ДНК, рестрикция ДНК, ПЦР и др.), являются модификацией известных методов (Маниатис Т., 1984).

Определение устойчивости к антибиотикам проводилось диско-диффузионным методом, антагонистической активности – методом перпендикулярных штрихов. Определение глутаматдегидрогеназной, трансаминазной, аминоксидазной активностей  и микотоксинов – методом ТСХ. Определение декарбоксилаз аминокислот – с использованием основы бульона Мюллера и методом ВЭЖХ. Определение белка в клеточных экстрактах микроорганизмов – методом Брэдфорд. НАД и НАДФ-зависимые глутаматдегидрогеназные (ГДГ) активности были измерены в свежих клеточных экстрактах, используя тест, основанный на колориметрическом определении                               L-глутаминовой кислоты в пищевых продуктах (Boehringer Mannheim, Германия). Способность связывать ионы металлов переменной валентности Cu²⁺ и Fe²⁺, каталазная, пероксидазная, супероксиддисмутазная активности определялись спектрофотометрически. Определение денитрифицирующей активности – методом Грисса. Определение бактериоцинов осуществлялось экспресс-методом с нейтрализацией молочной кислоты. Бактериологическое исследование проводили согласно ГОСТ 9958.

Определение органических кислот проводилось методом  ВЭЖХ на хроматографе «Alliance» (Separations Module Waters 2695, Photodiode Array detector Waters 2996); колонка ReproSil-Pur C18-AQ, 5 мкм, 250×4,0 мм, температура колонки 30 °С, инжекция           5 мкл.

Для проведения газохроматографических исследований использовали капиллярный газовый хроматограф фирмы Hewlett Packard (США) HP 5730 с пламенно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой SPB-1 (50 м × 0,32 мм, слой фазы 0,25 мкм).  Аминокислотный анализ проводили с использованием хроматографии на сульфо-полистирольном ионообменнике с элюцией ступенчатым градиентом Na-цитратных буферных растворов на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония).

Клинические испытания in vivo проводились в соответствии с санитарными правилами СП 3.3.2.561-96 «Государственные испытания и регистрация новых медицинских иммунологических препаратов» в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Молекулярно-генетическая экспертиза проводилась в соответствии с                             МУ 2.3.2.1830-04 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов».

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили по стандартным программам и общепринятым алгоритмам с использованием регрессионного анализа и оптимизации.

 

 

Рис. 1. Схема проведения эксперимента

 

Глава 3. Направленный отбор и идентификация стартовых  культур

 

Молочнокислые бактерии и денитрифицирующие стафилококки

В работе было проведено выделение  микроорганизмов из высококачественных спонтанно ферментированных мясных изделий, были изучены культуральные, физиолого-биохимические, технологические, пробиотические свойства. Для того чтобы отобрать отечественные конкурентоспособные штаммы, параллельно проводилась работа по изучению технологически-ценных свойств стартовых культур импортных бактериальных препаратов. 

Идентификацию на уровне штамма (генетическое типирование) проводили методом ПЦР с анализом полиморфизма случайно амплифицированных последовательностей ДНК. Таксономический статус микроорганизма устанавливали на основании фенотипических свойств в сочетании с генетической идентификацией, используя такие методы, как ДНК-ДНК гибридизация, сиквенс 16S рРНК, RAPD-ПЦР и др. При проведении анализа нуклеотидных последовательностей вариабельный участков 16S рРНК продукты амплификации участка 16S рРНК после проведения электрофореза в агарозном геле визуализировали в УФ-свете на приборе УФ-трансиллюминатора УВТ-1 при помощи программы BioTest. Нуклеотидная последовательность амплифицированных участков 16S рРНК была получена в результате секвенирования на автоматическом секвенаторе CEQ 8000 Genetic Analysis System (Beckman Coulter, США). Для подтверждения идентичности штамма тем микроорганизмам, таксономический статус которых уже установлен, были использованы молекулярно-биологические базы данных http://rdp.cme.msu.edu/. В результате были отобраны и идентифицированы бактерии, отнесенные к 11 видам, депонированные в ВКПМ ФГУП ГосНИИгенетика.