Теоретическое обоснование совершенствования промышленно-ценных свойств стартовых культур и их практическое применение в технологии мя

По результатам исследований была создана Коллекция стартовых культур МГУПБ, в которую вошли технологичные штаммы с отсутствием патогенности и токсигенности, а также трансмиссивной антибиотикоустойчивости. Штаммы депонированы в ВКПМ ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов и хранятся в лиофилизированном виде, что подтверждается справками о депонировании, в том числе национальном патентном депонировании. На каждый штамм оформлен паспорт, в котором отражена информация об его точной таксономической идентификации, источнике выделения, характере устойчивости к антибиотикам с оценкой ее потенциальной опасности в плане переноса, перечислены основные фенотипические, генотипические и промышленно-ценные свойства.

 

ГЛАВА 5. Изучение промышленно-ценных свойств стартовых  культур

 

Определение аминоксидазной активности у стартовых  культур

 

Потенциальная роль микроорганизмов, имеющих аминоксидазную активность, используемых в ферментации продуктов питания, заключается в прекращении образования или снижении аккумулирования БА в продуктах питания. Аминоксидазы участвуют также в обезвреживании аминов, образующихся в кишечнике под влиянием гнилостных бактерий. Поэтому аминоксидазная активность должна рассматриваться как важная характеристика при селекции стартовых культур, а также пробиотиков.

Аминоксидазная активность у исследуемых  микроорганизмов определялась по способности  снижать содержание БА (гистамина, тирамина, кадаверина, путресцина). На первом этапе методом ТСХ были выбраны штаммы, при инкубировании с которыми количество биогенных аминов в пробах снижалось. Уровни активности ферментов аминоксидаз были определены с помощью ВЭЖХ.

Амины обнаруживались на хроматографической пластинке в виде фиолетовых пятен (например, рис. 5). По разности размеров и интенсивности окраски пятен, соответствующих контрольному образцу и анализируемой пробе, определяли, имело ли место снижение концентрации амина, т.е. проявление аминоксидазной активности.

 

Рис. 5. Картина тонкослойной хроматографии путресцина

0 – начальная концентрация  амина, 1 – P. acidilactici 33, 2 – P. acidilactici 34, 3 – P. pentosaceus 23, 4 – P. acidilactici 27, 5 – P. pentosaceus 106, 6 – P. acidilactici 3, 7 – P. pentosaceus 28, 8 –                         P. pentosaceus 39, 9 – S. carnosus 108, 10 – P. acidilactici 25, 11 – L. sakei 104, 12 – P. pentosaceus 31, 13 – P. acidilactici 38

 

По результатам ТСХ  для дальнейшего количественного анализа были выбраны следующие штаммы, показавшие наибольшую аминоксидазную активность: L. plantarum 22/2, 32, L. curvatus 102, 2, L. sakei 104, 35; L. casei 10; P. acidilactici 3, 25, 27, 33, 38;                    S. carnosus 108. Количественное определение снижения уровня биогенных аминов было проведено методом ВЭЖХ (табл. 2).

Таблица 2

Количественная  оценка способности микроорганизмов  разрушать биогенные амины

Название микроорганизма	Биогенные амины
	Гистамин	Тирамин	Кадаверин	Путресцин
	Начальное количество БА в образце, мг/л
	737,11±31,29	265,63±12,16	128,93±5,33	89,30±3,45
	Количество БА в образце через 96 ч инкубации, мг/л
Lactobacillus curvatus 2	–	3,13±0,15	0,332±0,015	0,830±0,04
Lactobacillus curvatus 102	0,719±0,035	–	–	1,66±0,31
Lactobacillus sakei 35	–	–	0,128±0,001	–
Lactobacillus sakei 104	–	62,39±3,23	–	–
Lactobacillus casei 10	386,28±15,34	207,27±9,35	–	0,480±0,022
Lactobacillus plantarum 32	60,558±0,98	52,412±3,31	0,958±0,036	–
Lactobacillus plantarum 22/2	–	–	0,186±0,008	0,674±0,033
Pediococcus acidilactici 3	163,81±7,18	–	0,093±0,004	–
Pediococcus acidilactici 25	131,76±6,23	259,94±9,92	–	0,293±0,015
Pediococcus acidilactici 27	129,16±5,44	–	0,121±0,006	–
Pediococcus acidilactici 38	151,81±7,17	–	–	–
Pediococcus acidilactici 33	184,40±8,36	270,62±13,45	0,314±0,013	–
Staphylococcus carnosus 108	561,03±23,07	–	–	0,686±0,031

Установлено, что активность фермента аминоксидазы зависит скорее от штамма, а не от вида микроорганизма, т.е. является штаммоспецифичным признаком. Проведенный скрининг позволил охарактеризовать микроорганизмы по уровню их аминоксидазной активности и рекомендовать ряд штаммов для использования в мясной промышленности в качестве стартовых культур, повышающих безопасность и качество продуктов.

 

Стартовые культуры – продуценты бактериоцинов

Один из важнейших  эффектов стартовых культур –  это продление срока годности мясных продуктов. Считается, что молочнокислые  микроорганизмы подавляют жизнедеятельность  посторонней микрофлоры за счет выделения  органических кислот и, следовательно, снижения рН. Это неоспоримый факт, и снижение рН является частью комплексного действия молочнокислых микроорганизмов, что позволяет использовать их в качестве биоконсервантов. Однако проведенные научные исследования доказывают, что ингибирование роста условно-патогенной микрофлоры происходит в ряде случаев именно за счет антибактериальных белковых веществ – бактериоцинов. Это особенно важно при использовании бактериоцинов в чистом виде после предварительного выделения и очистки для тех мясных продуктов, при производстве которых понижение рН нежелательно.

Так как бактериоцины играют большую роль в природных  бактериальных сообществах, синтез этих веществ имеет значение для  конкуренции внутри популяции и  между ними. У бактериоциногенных популяций защитная активность проявляется в ингибировании развития других бактерий, обладающих сходными пищевыми потребностями, поэтому это свойство очень ценно для использования в мясных системах при подавлении жизнедеятельности нежелательной микрофлоры. Полученные результаты показали, что среди проверенных штаммов есть микроорганизмы, как с разным уровнем синтеза бактериоцинов, так и с разным спектром ингибирования санитарно-показательной микрофлоры, и подтверждают данные других авторов, что способность синтезировать бактериоцины не является видовой характеристикой микроорганизмов и относится к штаммоспецифическому признаку (табл. 3).

 Таблица 3

Способность молочнокислых  микроорганизмов продуцировать  бактериоцины

Название микроорганизма	Номер ВКПМ	Киллерная активность микроорганизмов, %
		Salmonella typhymurium LT2	Proteus vulgaris ATCC 13315	Escherichia coli K-12 C 600	Staphylococcus aureus subsp. aureus 209P
Lactobacillus curvatus 1	В-8889	1	0	0	0
Lactobacillus curvatus 2	В-8906	0	0	27	34
Lactobacillus curvatus 102	В-8900	21	30	34	44
Lactobacillus curvatus 301-1	В-8954	0	0	0	0
Lactobacillus curvatus CDN	В-8948	25	0	0	0
Lactobacillus sakei 35	В-8886	21	7	0	9
Lactobacillus sakei 45	В-8896	0	0	0	27
Lactobacillus sakei 101	B-8939	0	47	39	30
Lactobacillus sakei 103	В-8932	33	35	35	50,1
Lactobacillus sakei 104	В-8936	26	10	30	64,8
Lactobacillus sakei 105	В-8905	62	17	56	13
Lactobacillus sakei 306-1	В-8949	0	0	0	0
Lactobacillus sakei 111-1	В-8952	0	28	0	72
Lactobacillus casei 10	В-8890	0	0	0	15
Lactobacillus plantarum 19	В-8907	0	8	27	35
Lactobacillus plantarum 21	B-8654	0,2	0	20	53
Lactobacillus plantarum 100	В-8899	40	20	34	31
Lactobacillus plantarum 7К	В-2663	0	57	28	30
Lactobacillus plantarum 22/2	В-1615	34	0	0	19
Lactobacillus plantarum 2П	В-1616	0	27	0	57
Lactobacillus plantarum 31	В-1617	48	13	21	17
Lactobacillus plantarum 32	В-1618	0	0	37	49
Pediococcus acidilactici 3	В-8891	62	0	33	29
Pediococcus acidilactici 8	В-8897	72	0	38	51
Pediococcus acidilactici 15	В-8895	24	0	0	0
Pediococcus acidilactici 25	В-8892	0	0	27	44
Pediococcus acidilactici 27	В-8893	61	0	34	67
Pediococcus acidilactici 33	В-8903	24	5	0	0
Pediococcus acidilactici 34	В-8887	0	0	0	0
Pediococcus acidilactici 38	В-8902	58	27	50	22
Pediococcus pentosaceus 23	В-8894	96	2	32	54
Pediococcus pentosaceus 28	В-8888	58	65	39	65
Pediococcus pentosaceus 31	В-8901	8	0	0	3
Pediococcus pentosaceus 39	В-8898	0	52	34	30
Pediococcus pentosaceus 55	В-8955	78	75	72	65
Pediococcus pentosaceus 106	В-8935	51	34	35	30
Pediococcus claussenii 9	В-8908	2	0	0	0
Staphylococcus xylosus 45	В-8945	0	0	0	2
Staphylococcus xylosus P-1	В-8944	21	0	0	20
Staphylococcus xylosus SAL-1	В-8946	8	1	0	0
Staphylococcus xylosus 96-2	В-8947	48	52	0	9
Staphylococcus carnosus 108	В-8953	38	26	0	0
Staphylococcus carnosus 301-2	В-8950	11	45	0	0
Staphylococcus carnosus 111-2	В-8951	11	0	0	0
Macrococcus caseolyticus 38	В-1619	9	0	0	0

Как наиболее перспективные  для использования в пищевой  промышленности в качестве штаммов  биоконсервантов можно выделить следующие микроорганизмы, чья киллерная активность в отношении санитарно-показательной микрофлоры превысила 50%: L. curvatus 1, L. sakei 103, L. sakei 104, L. sakei 105, L. plantarum 2П, L. plantarum 7К, P. pentosaceus 23, P. pentosaceus 28, P. acidilactici 27, P. acidilactici 3, P. acidilactici 8,                  P. acidilactici 38, P. pentosaceus 55, P. pentosaceus 106.

 

Образование ароматических соединений стартовыми культурами

 

Ароматические соединения, полученные в результате жизнедеятельности микроорганизмов, оказывают значительное влияние на формирование суммарного аромата ферментированных мясных продуктов. Катаболизм аминокислот – это главный процесс для ароматообразования в ферментированных мясных продуктах, аромат которых в значительной степени формируется за счет альдегидов, спиртов и кислот, полученных из ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана), аминокислот с разветвленной цепью (лейцина, изолейцина, валина) и серосодержащих компонентов, полученных из метионина. Реакция трансаминирования является ключевой в формировании ароматических компонентов из аминокислот под действием стартовых культур, в которой α-кетокислоты превращаются в различные ароматические соединения, такие как альдегиды, карбоксикислоты и серосодержащие соединения. Для конверсии             L-глутамата, содержащегося в мясном сырье в большом количестве, в α-кетоглутарат требуется присутствие молочнокислых микроорганизмов с глутаматдегидрогиназной (ГДГ) активностью. Глутаматдегидрогеназа – это фермент, который катализирует обратимое окислительное дезаминирование глутамата в α-кетоглутарат и аммоний, используя НАД⁺, НАД(Ф)⁺ или оба в качестве кофакторов.

В табл. 4 представлена относительная  активность фермента глутаматдегидрогеназы  ГДГ-позитивных штаммов.

Таблица 4

Определение глутаматдегидрогеназной  активности

 

Штамм	Относительная активность ГДГ, ед. ОП492/мкг белка×100
Lactobacillus plantarum 7K	68,52
Lactobacillus plantarum 22/2	3,38
Lactobacillus plantarum 2П	1,44
Lactobacillus plantarum 31	0,94
Lactobacillus plantarum 32	0,99
Lactobacillus plantarum 21	7,18
Lactobacillus plantarum 19	4,58
Lactobacillus plantarum 100	1,22
Lactobacillus curvatus 2	14,63
Lactobacillus sakei 104	2,11
Lactobacillus sakei 35	6,18
Pediococcus acidilactici 8	3,81
Pediococcus acidilactici 25	2,93
Pediococcus pentosaceus	7,11
Pediococcus pentosaceus 106	5,23
Staphylococcus carnosus 111-2	68,91

По данным табл. 4 можно  видеть, что наибольшей ГДГ активностью  обладают штаммы L. plantarum 7K (68,52) и S. carnosus 111-2 (68,91), последний выбран в качестве контроля как ароматобразующий микроорганизм. Полученные результаты подтверждают, что предложенная методика может быть использована для скрининга штаммов, способных образовывать ароматические соединения. Далее, по убыванию ГДГ активности, были выбраны следующие микроорганизмы: L. curvatus 2 (14,63), L. plantarum 21 (7,18), L. sakei 35 (6,18), P. pentosaceus 106 (5,23).

 

Изучение  связи активности глутаматдегидрогеназы  микроорганизмов и превращения  аминокислот в ароматические соединении

 

Для доказательства того, что штаммы, у которых была определена высокая  активность ГДГ, действительно способны образовывать ароматические соединения из аминокислот, они были инкубированы с аминокислотами в присутствии глутаминовой кислоты или α-кетоглутарата. Катаболизм аминокислот был изучен у ГДГ-позитивных штаммов методом ТСХ. В качестве отрицательного контроля был взят штамм L. sakei 45, у которого не было обнаружено ГДГ активности (рис. 6, 7).

Данные ТСХ показывают, что штаммы с ГДГ активностью  конвертируют аминокислоты как в  присутствии α-кетоглутарата, так  и без него. За счет своей ферментативной активности микроорганизмы превращают глутаминовую кислоту в                  α-кетоглутарат, который и служит акцептором для аминогрупп. Штамм L. sakei 45, не обладающий ГДГ активностью, не конвертировал аминокислоты в присутствии глутаминовой кислоты. В присутствии α-кетоглутарата происходила конверсия 100% лейцина, 75% триптофана, 50% фенилаланина, 60% тирозина. Этот факт подтверждает, что для превращений аминокислот и получения ароматических соединений необходимы микроорганизмы с активным ферментом глутаматдегидрогеназой.

 

  

 

 

Рис. 6. Картина тонкослойной хроматографии катаболизма аминокислот  штаммом Staphylococcus carnosus 111-2 в присутствии глутаминовой кислоты

Рис. 7. Картина  тонкослойной хроматографии катаболизма  аминокислот штаммом Lactobacillus sakei 45 в присутствии глутаминовой кислоты

 

Обозначения к рис. 6 и 7: к – аминокислота, 150 мг/л, 0 – количество аминокислоты в инкубационной среде до начала инкубации, 24 – количество аминокислоты после 24 ч инкубации с клетками.

 

Для ароматобразующего штамма L. plantarum 7К были определены ароматические соединения, которые образовывались в результате катаболизма ароматических аминокислот, аминокислот с разветвленной цепью и метионина. Карбоксильные аминокислоты определяли с помощью ВЭЖХ (рис. 8).