Автор работы: Пользователь скрыл имя, 31 Января 2014 в 18:46, автореферат
В настоящее время производственные процессы, основанные на жизнедеятельности микроорганизмов, приобрели огромное значение. Современная биотехнология прямо или косвенно связана с генной инженерией – созданием новых форм микроорганизмов путем непосредственного изменения их генетической системы для получения высокоэффективных полезных штаммов, что влечет за собой увеличение разнообразия биотехнологической продукции. XXI век объявлен Организацией объединенных наций веком биотехнологии. Достижение превосходства в биотехнологии – одна из важных задач в экономической политике промышленных государств.
На правах рукописи
МАШЕНЦЕВА НАТАЛЬЯ ГЕННАДЬЕВНА
ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ПРОМЫШЛЕННО-ЦЕННЫХ СВОЙСТВ СТАРТОВЫХ КУЛЬТУР И ИХ ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ В ТЕХНОЛОГИИ МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ
Специальность 05.18.07 – Биотехнология пищевых продуктов
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора технических наук
Москва – 2008
Работа выполнена на кафедре «Технология мяса и мясных продуктов» Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» (ГОУ ВПО МГУПБ)
Официальные оппоненты:
Доктор технических наук, профессор В.И. Ганина
Доктор биологических наук, профессор Ю.Д. Цыганков
Доктор технических
наук
Ведущая организация:
Государственное научное
учреждение Всероссийский научно-
Защита диссертации состоится «___» _________2008 г. в ______часов на заседании Диссертационного совета Д 212.149.01. при ГОУ ВПО «Московский государственный университет прикладной биотехнологии» по адресу: 109316, г. Москва, ул. Талалихина, 33, конференц-зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПБ.
Автореферат разослан «___» ________ 2008 г.
Ученый секретарь
кандидат технических
наук, профессор
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. В настоящее время производственные процессы, основанные на жизнедеятельности микроорганизмов, приобрели огромное значение. Современная биотехнология прямо или косвенно связана с генной инженерией – созданием новых форм микроорганизмов путем непосредственного изменения их генетической системы для получения высокоэффективных полезных штаммов, что влечет за собой увеличение разнообразия биотехнологической продукции. XXI век объявлен Организацией объединенных наций веком биотехнологии. Достижение превосходства в биотехнологии – одна из важных задач в экономической политике промышленных государств. Возможно, что в XXI веке биотехнология окажет решающее воздействие на решение таких важных проблем, как охрана здоровья, обеспечение человека продовольствием, охрана окружающей природы и энергообеспечение.
Тенденцией сегодняшнего дня является создание функциональных продуктов питания с целью улучшения здоровья потребителя. Чаще всего в этой роли выступают кисломолочные продукты, в состав которых входят живые пробиотические культуры. Эффективность и безопасность этих микроорганизмов для здоровья доказаны за долгие годы их применения (http://www.effca.com). Сухие колбасы и другие ферментированные мясные продукты также могут быть «курьерами» для доставки пробиотиков в желудочно-кишечный тракт человека.
Одним из основных аспектов биотехнологии является обеспечение безопасности мясных продуктов, поэтому для гарантии безопасности Институт питания РАМН обязательно рекомендует в технологиях производства мясопродуктов, не подвергающихся тепловой обработке, предусматривать добавление в рецептуру эффективных в отношении санитарно-показательной микрофлоры стартовых культур (Шевелева С.А., 2007).
Микробная биотехнология предлагает новые подходы к переработке нетрадиционных видов сельскохозяйственного сырья, появлению безотходных и усовершенствованию классических технологий мясопродуктов, и созданию широкого спектра полноценных высококачественных продуктов питания.
Фундаментальные основы промышленной биотехнологии микроорганизмов, направленной на получение продуктов питания нового поколения, заложены в трудах Ганиной В.И., Костенко Ю.Г., Липатова Н.Н. (мл), Митасевой Л.Ф., Рогова И.А., Семенихиной В.Ф., Соловьева В.И., Титова Е.И., Токаева Э.С., Хорольского В.В., Bover-Cid S., De Vuyst L., Eerola S., Klaenhammer T.R., Leroy F., Madsen S.M., Niinivaara F., Tanous C., Vandamme E.J. и др.
В пищевой промышленности до последнего времени использовали штаммы микроорганизмов, выделенные из природы. В других промышленных технологиях применяются оптимизированные штаммы, создание которых является важной частью микробиологического синтеза.
Вопросами совершенствования
промышленных микроорганизмов традиционно за
Конструирование высокопродуктивных
штаммов микроорганизмов с
Цель работы – теоретически обосновать и разработать научные принципы совершенствования свойств стартовых культур, позволяющих управлять биотехнологической переработкой сельскохозяйственного сырья, гарантирующей качество и безопасность мясных продуктов.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
Научная новизна. Теоретически обоснована и предложена схема направленного отбора молочнокислых бактерий, денитрифицирующих стафилококков, дрожжей и мицелиальных грибов. Проведена идентификация молочнокислых бактерий с применением классических фенотипических методов в сочетании с генетическими методами в соответствии с рекомендациями ФАО/ВОЗ. Проведена идентификация дрожжей и мицелиальных грибов по совокупности микро- и макроморфологических свойств. У выделенных штаммов мицелиальных грибов вида Penicillium camembertii были исследованы вторичные метаболиты. Результаты показали, что ни один из штаммов P. camembertii не продуцирует характерные для данного вида микотоксины, а именно циклопиазоновую кислоту (ЦПК) и ругуловазины А и В.
Обоснована возможность использования энтерококков в качестве стартовых культур. Исследования на тестовых питательных средах (тесты на протеолитическое разжижение желатина, ДНКазу и гемолизин) показали отсутствие факторов вирулентности у штаммов Enterococcus faecalis. Поиск генов, отвечающих за признаки патогенности энтерококков: прикрепление бактерий к поверхности эукариотической клетки (agg), синтез токсина, обеспечивающего гемолиз эритроцитов, (gelE), cylA – активация цитолизина и esp – внеклеточный поверхностный протеин, необходимый E. faecalis для колонизации мочевыводящих путей и образования биопленок, показал присутствие генов agg и gelE в геномах исследуемых штаммов E. faecalis, хотя и не проявляющих свою активность фенотипически.
Изучена проблема распространения
антибиотикоустойчивости у
Разработан системный подход направленного отбора и оптимизации свойств бактерий, позволяющий управлять технологическими процессами производства мясных продуктов, и схемы конструирования штаммов с заданными свойствами: «Схема получения суперэкспрессии гена Y» и «Схема получения делеции участка ДНК, кодирующего ген Y».
Изучена генетическая природа бактериальной денитрификации. Проведено сравнение нитритредуктазной активности штаммов S. carnosus и S. xylosus коллекций МГУПБ и ВКПМ. Сконструирован термочувствительный челночный вектор pBTmcs для репликации в грамположительных бактериях. Получен мутантный штамм S. carnosus (thyA–) на основе штамма S. carnosus B-8953. Клонирован и использован селективный маркер – ген, кодирующий фермент тимидилат синтетазу. Сконструирована экспрессионная плазмида для грамположительных бактерий, включающая сильный промотор гена, кодирующего фермент глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу. С помощью генетических преобразований путем замены промоторной области гена nirR на сильный промотор гена gap на основе штамма S. carnosus (thyA–) получен штамм-суперпродуцент фермента нитритредуктазы S. carnosus LIA-96 (ВКПМ В-9518). Определена значимость наличия всех белковых продуктов нитритредуктазного оперона штамма S. carnosus для активного восстановления нитрита.
Выявлены причины образования биогенных аминов (БА) в мясных продуктах и их влияние на организм человека. Проведен скрининг штаммов с низкой декарбоксилазной активностью или с полным ее отсутствием. Определены генетические детерминанты – tdc гены декарбоксилаз аминокислот у ряда штаммов L. sakei, образующих биогенные амины выше допустимого уровня. Предложен подход к созданию методами генной инженерии штаммов с выключенной декарбоксилазной активностью делецией участка хромосомы с геном tdc. Выбраны штаммы с аминоксидазной активностью, снижающие содержание биогенных аминов в мясных продуктах.
Систематизирована информация о классификации бактериоцинов, механизмах их действия, влиянии условий культивирования штаммов-продуцентов на синтез бактериоцинов стартовыми культурами и методов их определения. Проведен поиск продуцентов бактериоцинов с применением экспресс-метода с нейтрализацией молочной кислоты. Изучена генетика продуцирования бактериоцинов, и определена локализация генетических детерминантов синтеза бактериоцинов у педиококков. Предложены пути к повышению синтеза бактериоцинов стартовыми культурами.
Объяснен механизм ароматообразования в мясных продуктах за счет использования стартовых культур, и определены критерии отбора ароматобразующих микроорганизмов. Проведен скрининг ароматобразующих штаммов с глутаматдегидрогеназной активностью, и изучено их влияние на образование ароматических соединений. Определены генетические детерминанты – гены gdh, кодирующие фермент глутаматдегидрогеназу. Предложен подход к созданию методами генной инженерии штаммов с суперэкспрессией гена gdh.
У стартовых культур определены супероксиддисмутазная (СОД), каталазная, пероксидазная активности и способность связывать ионы металлов переменной валентности Fe2+ и Cu2+, способствующие инактивации производных форм кислорода. Определены генетические детерминанты фермента супероксиддисмутазы – sodA гены у микроорганизмов различных таксонов. Предложен подход к созданию методами генной инженерии штаммов с суперэкспрессией гена sodA.
Предложены научные и
Практическая значимость и реализация результатов. Создана коллекция стартовых культур для мясной промышленности, содержащая микроорганизмы следующих видов: Lactobacillus curvatus, Lactobacillus sakei, Lactobacillus casei, Lactobacillus plantarum, Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus claussenii, Macrococcus caseolyticus, Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xylosus, Debaryomyces vanriji, Debaryomyces polymorphus, Debaryomyces hansenii, Candida famata, Penicillium camembertii.