Валидационная оценка методов анализа новокаина в растворе для инъекций

В мерные колбы вместимостью 100 мл последовательно вносили 0,5 мл; 0,75 мл; 1,0 мл; 1,25 мл; 1,5 мл раствора А и доводили объем растворов водой до метки (получали 0,00050%; 0, 00075%; 0,00100%; 0,00125% и 0,00150% растворы).

Измеряли оптическую плотность каждого раствора на спектрофотометре при  длине волны 288 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствор сравнения – вода очищенная. Параллельно измеряли оптическую плотность 0,001% раствора прокаина.

Результаты определения представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Результаты измерения оптической плотности

C, %	0,0005	0,00075	0,001	0,00125	0,0015
D	0,242	0,360	0,493	0,615	0,745

 

 

 

По полученным данным строили градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации.

 

V, мл

                                                                                                                                     %

Рисунок 2 –Градуировочный график зависимости оптической плотности от концентрации новокаина гидрохлорида

Как следует из представленного графика, все экспериментальные точки находятся вблизи линии тренда (прямой линии).

По полученным данным рассчитывали уравнение градуировочного графика и коэффициент корреляции:

 

r = 1,00

Для данной выборки значение коэффициента корреляции составило 1,00. Это позволяет утверждать о наличии достаточно жесткой линейной зависимости оптической плотности от концентрации.

 

2.4 Валидационная  оценка методик количественного  определения новокаина гидрохлорида по показателю «Правильность»

 

Правильностью аналитической методики называется степень близости экспериментальных результатов к истинному значению во всей области измерений. Главным фактором, определяющим правильность, является значение систематической погрешности.

Для оценки правильности методик количественного определения активной субстанции применимы следующие подходы:

• применение аналитической методики к образцу с известной степенью чистоты, например к стандартному образцу;
• сравнение результатов анализа, полученных с использованием валидируемой методики и арбитражного метода, правильность и прецизионность которого известны;
• заключение о правильности можно сделать после того, как установлены прецизионность, линейность и специфичность.

Для оценки правильности методик количественного определения готового лекарственного препарата:

• применение методики к искусственным (модельным) смесям, к которым были добавлены известные количества анализируемого вещества;
• если невозможно получить образцы всех компонентов лекарственного препарата, возможно применение метода добавок или арбитражной методики, правильность которой доказана
• заключение о правильности можно сделать после того, как установлены прецизионность, линейность и специфичность.

Для тестирования методики на правильность готовятся три модельные смеси из разных навесок с точным содержанием каждого из компонентов, включая и вспомогательные вещества. Согласно рекомендациям ICH необходимо проанализировать не менее 9 образцов на 3 уровнях концентраций. Правильность методики устанавливается в указанном диапазоне ее применения. Для оценки полученных результатов наиболее простым и наглядным критерием служит открываемость (R), которая вычисляется по формуле:

 

При проведении анализа будут получены 9 значений открываемости.

Для более детальной оценки следует статистически обработать полученные значения R, рассчитав стандартное и относительное стандартное отклонение.

Для того чтобы сделать вывод о полученных результатах, следует иметь ввиду, что для анализа субстанций с содержанием действующего вещества не менее 98%, значения правильности должны быть в пределах 99-101%. При анализе субстанций с нормой содержания действующего вещества менее 98%, в пределах 98-102%. Для лекарственных препаратов с различным содержанием определяемого компонента рекомендуются следующие интервалы правильности (таблица 6):

Таблица 6 – Оценка правильности в зависимости от концентрации активного компонента в анализируемом образце

Содержание аналита в образце, %	Открываемость,%
100	98 – 102
≥10	98 – 102
≥1	97 – 103
≥0,1	95 – 105
0,01	90 – 107
0,001	80 – 110
0,0001	80 – 110
0,00001	60 – 115
0,000001	40 – 120

 

 

2.4.1 Определение правильности методики

 титриметрического анализа

Для определения правильности приготовили 3 модельных раствора новокаина гидрохлорида (таблица 7):

Таблица 7- Приготовление модельных смесей  раствора новокаина гидрохлорида

Модельная смесь	1	2	3
Навеска  новокаина гидрохлорида  (г)	0,25	0,50	0,75
Раствора кислоты хлороводородной 0,1 моль/л	До рН 3,8 – 4,5	До рН 3,8 – 4,5	До рН 3,8 – 4,5
Воды для инъекций	До 100 мл	До 100 мл	До 100 мл

 

Раствор А1. Точную навеску новокаина гидрохлорида (0,25 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют воды для инъекций 50 мл,  раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 – 4,5 и доводят объем раствора до метки водой для инъекций.

Раствор А2. Точную навеску новокаина гидрохлорида (0,5 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют воды для инъекций 50 мл,  раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 – 4,5 и доводят объем раствора до метки водой для инъекций.

Раствор А3. Точную навеску новокаина гидрохлорида (0,75 г) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, добавляют воды для инъекций 50 мл,  раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 – 4,5 и доводят объем раствора до метки водой для инъекций.

Далее проводили 3 параллельных титрования на трех уровнях концентраций (9 определений), по методике количественного определения, отмеривая по 10 мл каждого из модельных растворов (А1 , А2,  А3).

Расчет содержания новокаина гидрохлорида в % (открываемость) проводят по формуле:

 

где:   V– объем титранта, мл;

К– поправочный коэффициент;

Т–  титр  0,05М раствора натрия нитрита по определяемому веществу, мг/мл;

а –  навеска раствора А, взятая на анализ, мл;

С – содержание новокаина гидрохлорида в исходном растворе (0,25; 0,5; 0,75 г).

Результаты представлены в  таблице 8.

 

 

Таблица 8 - Результаты установления правильности методики титриметрического определения новокаина гидрохлорида

№ п/п	Уро- вень	Взято лек. вещества, г	Найдено лек. вещества, г	R%	Метрологические характеристики
1	1	0,025	0,0254	101,6
2	1	0,025	0,0252	100,8
3	1	0,025	0,0252	100,8
4	2	0,050	0,0503	100,6
5	2	0,050	0,0501	100,2
6	2	0,050	0,0500	100,0
7	3	0,075	0,0748	99,73
8	3	0,075	0,0751	100,1
9	3	0,075	0,0753	100,4

 

 

Коэффициент открываемости прокаина гидрохлорида при использовании титриметрической методики составил 100,47% (RSD=0,56%). Это свидетельствует об удовлетворительной правильности методики анализа.

2.4.2 Определение правильности методики

 спектрофотометрического анализа

Для определения правильности приготовили 3 модельных раствора новокаина гидрохлорида (таблица 9):

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 9 - Приготовление модельных смесей  раствора новокаина гидрохлорида

Модельная смесь	1 (А1)	2 (А2)	3 (А3)
Навеска  новокаина гидрохлорида  (г)	0,025	0,05	0,075
Раствора кислоты хлороводородной 0,1 моль/л	До рН 3,8 – 4,5	До рН 3,8 – 4,5	До рН 3,8 – 4,5
Воды для инъекций	До 10,0 мл	До 10,0 мл	До 10,0 мл

 

Раствор А1.  Точную навеску новокаина гидрохлорида (0,025 г) помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, добавляют воды для инъекций 5 мл,  раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 – 4,5 и доводят объем раствора до метки водой для инъекций.

Раствор А2. Точную навеску новокаина гидрохлорида (0,05 г) помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, добавляют воды для инъекций 5 мл, раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 – 4,5 и доводят объем раствора до метки водой для инъекций.

Раствор А3. Точную навеску новокаина гидрохлорида (0,075 г) помещают в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, добавляют воды для инъекций 5 мл,  раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 – 4,5 и доводят объем раствора до метки водой для инъекций.

Раствор Б1. В мерную колбу вместимостью 10 мл переносят 1,0 мл раствора А1 и доводят водой до метки (0,025% раствор).

Раствор Б2. В мерную колбу вместимостью 10 мл переносят 1,0 мл раствора А2 и доводят водой до метки (0,05% раствор).

Раствор Б3. В мерную колбу вместимостью 10 мл переносят 1,0 мл раствора А3 и доводят водой до метки (0,075% раствор).