Валидационная оценка методов анализа новокаина в растворе для инъекций

1. Не менее девяти определений, охватывающих диапазон применения  методики (например, три концентрации / три определения для каждой);

2. Не менее шести определений  для образцов с содержанием  анализируемого вещества, близким  к номинальному количеству.

Затем вычисляют величину стандартного отклонения (SD) и относительного стандартного отклонения (RSD).

Следует отметить, что ни один нормативный документ не устанавливает нижнюю границу прецизионности и она определяется используемым методом анализа:

В фармацевтическом анализе для нормирования значений прецизионности наиболее оптимальными можно считать рекомендации американской ассоциацией аналитической химии (АОАС), в которой приводятся данные оценки сходимости как функции аналитических концентраций (табл. 2) [13].

 

 

 

Таблица 1 – Данные оценки прецизионности как функции концентрации анализируемого компонента

Содержание анализируемого компонента в образце, %	Относительное стандартное отклонение (RSD)
100	1,3
10	2,8
1	2,7
0,1	3,7
0,01	5,3
0,001	7,3
0,0001	11,0
0,00001	15,0
0,000001	21,0
0,0000001	30,0

 

 

2.2.1 Определение прецизионности методики

титриметрического анализа

 

Для определения прецизионности методики нитритометрического титрования приготовили модельную смесь.

Для этого точную навеску новокаина гидрохлорида (0,05 г) помещали в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, добавляли воды для инъекций 5 мл, раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 – 4,5 и доводили объем раствора до метки водой для инъекций. Далее проводили:

• Определение №1.

3 параллельных титрования, отмеривая каждый раз по 5 мл  ЛП.

• Определение №2.

3 параллельных титрования, отмеривая каждый раз по 10 мл  ЛП.

• Определение №3.

3 параллельных титрования, отмеривая каждый раз по 15 мл  ЛП.

Расчет содержания прокаина гидрохлорида (г/мл) проводили по формуле:

 

Результаты заносили в таблицу 2 и рассчитывали стандартное отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD).

 

Таблица 2 - Результаты установления прецизионности методики титриметрического определения прокаина гидрохлорида

Навеска, взятая на анализ, г	Объем аликвоты, взятый на анализ, мл	Объем титранта, мл	Найдено, г/мл	Метрологические характеристики
0,0500	5	1,83	0,00499	_        Х=0,00499     SD=0,00001986 RSD=0,40%
0,0500	5	1,84	0,00502
0,0500	5	1,83	0,00499
0,0500	10	3,65	0,00498
0,0500	10	3,67	0,00501
0,0500	10	3,66	0,00499
0,0500	15	5,50	0,00500
0,0500	15	5,45	0,00495
0,0500	15	5,50	0,00500

 

 

Следует отметить, что ни один нормативный документ не устанавливает нижнюю границу прецизионности и она определяется используемым методом анализа. Из данных таблицы 2 следует, что величина относительного стандартного отклонения методики нитритометрического титрования прокаина составила 0,40%, что является удовлетворительным для данного метода.

 

2.2.2 Определение прецизионности методики   спектрофотометрического анализа

Для определения прецизионности методики спектрофотометрического определения приготовили модельную смесь.

Для этого точную навеску новокаина гидрохлорида (0,05 г) помещали в мерную колбу вместимостью 10,0 мл, добавляли воды для инъекций 5 мл, раствор кислоты хлороводородной 0,1 моль/л до рН 3,8 – 4,5 и доводили объем раствора до метки водой для инъекций (раствор А). Далее в мерную колбу вместимостью 25 мл переносили 2,5 мл полученного раствора и доводили объем водой до метки (0,05% раствор) (раствор Б).

Затем готовили параллельно три раствора.

• Растворы В1, В2, В3.  В три мерные колбы вместимостью 50 мл помещали по 0,5 мл раствора Б, доводили объем водой до метки, перемешивали.
• Растворы В4, В5, В6. В три мерные колбы вместимостью 50 мл помещали по  1,0 мл раствора Б, доводили объемводой до метки, перемешивали.
• Растворы  В7, В8, В9.  В три мерные колбы вместимостью 50 мл помещают по 1,5 мл раствора Б, доводили объем водой до метки, перемешивали.

Измеряли оптическую плотность каждого из 9 приготовленных растворов на спектрофотометре при длине волны 288 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Параллельно измеряют оптическую плотность раствора СО новокаина гидрохлорида.

Расчет содержания новокаина гидрохлорида в г/мл проводят по формуле:

    ,

где:   Ах  –  оптическая плотность исследуемого раствора;

         Ао  –  оптическая плотность раствора СО новокаина;

0,00001  –  содержание   новокаина гидрохлорида в г  в 1 мл раствора СО.

V  –  объем раствора Б2, взятый для приготовления растворов В (0,5; 1,0 или 1,5 мл).

Результаты заносили в таблицу 3 и рассчитывали стандартное отклонение (SD) и относительное стандартное отклонение (RSD).

Таблица 3 - Результаты установления прецизионности методики спектрофотометрического определения прокаина гидрохлорида

Навеска, взятая на анализ, г	Объем аликвоты, взятый на анализ, мл	Оптическая плотность	Найдено, г/мл	Метрологические характеристики
0,0500	0,5	0,245	0,00496	_        Х=0,00501     SD=0,0000421 RSD=0,79%
0,0500	0,5	0,248	0,00506
0,0500	0,5	0,245	0,00496
0,0500	1,0	0,490	0,00500
0,0500	1,0	0,493	0,00503
0,0500	1,0	0,495	0,00505
0,0500	1,5	0,732	0,00498
0,0500	1,5	0,735	0,00500
0,0500	1,5	0,746	0,00507
А0 = 0,490

 

 

Из данных таблицы 3 следует, что величина относительного стандартного отклонения методики спектрофотометрического определения прокаина составила 0,79%, что является удовлетворительным для данного метода.

 

 

 

 

2.3 Валидационная оценка методик количественного определения

  новокаина гидрохлорида по показателю «Линейность»

Линейность методики - это наличие прямой пропорциональной зависимости оптической плотности от концентрации или количества определяемого вещества в анализируемой пробе. Линейность выражается уравнением у = ах +b. Это уравнение называют линейной регрессией. Параметр b градуировочной функции характеризует отрезок, отсекаемый на оси ординат и соответствующий значению холостого опыта, а коэффициент а характеризует наклон градуировочной кривой и является отражением чувствительности методики.

Расчет коэффициентов градуировочного графика проводят по формулам:

 

В химических методах анализа (титриметрия) аналитик не может повлиять на значения коэффициентов a и b. Однако, если при проведении контрольного опыта, титрант не расходуется, то градуировочный график принимает форму прямой, выходящей из начала координат, и имеющей тангенс угла наклона равный 1.

Значения параметров a и b вычисляются методом регрессионного анализа. В настоящее время  пользуются соответствующими компьютерными программами (например, Excel).

Основной характеристикой линейности является коэффициент корреляции — мера взаимосвязи измеренных явлений. Коэффициент корреляции (обозначается «r») рассчитывается по специальной формуле:

 

Для аналитических целей можно использовать только ту методику, для которой зависимость функции от аргумента коррелируется с коэффициентом r, который должен быть ≥0,99.

 

2.3.1 Определение линейности методики

титриметрического анализа

 

Для проверки линейности брали 5 экспериментальных точек. Для этого точную навеску новокаина (0,5 г) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяли  в воде, доводили объем водой до метки и перемешивали (раствор А).

На титрование отмеривали последовательно 5 мл; 10мл; 15 мл; 20 мл; 25 мл раствора (А), что соответствовало 0,025 г; 0,05 г; 0,075 г; 0,100 г; 0,125 г прокаина.

Данные вносили в таблицу 4.

Таблица 4 – Результаты титриметрического определения прокаина гидрохлорида

Навеска, мл	Навеска, г	Объем титранта, мл	Найдено, г
5	0,025	1,83	0,0249
10	0,050	3,60	0,0491
15	0,075	5,50	0,0750
20	0,100	7,30	0,0099
25	0,125	9,0	0,1228

 

По полученным данным строили градуировочный график зависимости содержания компонента от объема титранта.

V, мл

                                                                                                                       г

Рисунок 1 –Градуировочный график зависимости объема титранта от содержания новокаина гидрохлорида

Как следует из представленного графика, все экспериментальные точки находятся вблизи линии тренда (прямой линии). По полученным данным рассчитывали уравнение градуировочного графика и коэффициент корреляции:

 

r = 1,00

Для данной выборки значение коэффициента корреляции составило 1,00. Это позволяет утверждать о наличии достаточно жесткой линейной зависимости объема титранта от концентрации.

 

2.3.1 Определение линейности методики

спектрофотометрического анализа

Для этого точную навеску новокаина (0,1 г) помещали в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводили объем раствора водой до метки,  перемешивают (раствор А).