Генотерапия раковых заболеваний

1. Р-гликопротеин – основной  белок-транспортер множественной лекарственной устойчивости

Р-гликопротеин – крупный трансмембранный белок  с молекулярной массой 170 кДа  (gp170,  Pgp), состоящий из двух одинаковых частей, каждая из которых включает шесть гидрофобных трансмембранных участков. Это позволяет считать, что молекула Pgp 12 раз пересекает плазматическую мембрану клетки и имеет два  сайта связывания с АТФ, свидетельствующих об энергозависимости функционирования белка. Предполагается, что 12  трансмембранных доменов формируют поры или каналы, через которые Рgp активно выбрасывает вещества, и энергия гидролиза АТФ переносится от двух АТФ-связывающих доменов, обеспечивая работу выбрасывающего насоса.  

Рис. 1. Строение Р-гликопротеина

Р-гликопротеин – интегральный белок, имеющий 12 трансмембранных  доменов, пронизывающих бислой цитоплазматической мембраны. N- и С-концы белка обращены в цитозоль. Участки Р-гликопротеина на наружной поверхности мембраны гликозилированы. Область между шестым и седьмым доменами имеет центры для присоединения АТФ и аутофосфорилирования.  

Активность  Р-гликопротеина определяет резистентность опухолевых клеток ко многим противоопухолевым  лекарствам (антрациклиновым антибиотикам, алкалоидам растительного происхождения, в частности к винка-алкалоидам, подофиллотоксинам, таксанам и др.), а также ко многим другим веществам – флуоресцентным красителям (бромистому этидию – БЭ), пуромицину, грамицидину D и др.

Р-гликопротеин человека кодируется геном mdr1, принадлежащим к семейству mdr, локализованным в хромосоме 7. К МЛУ может приводить как изменение экспрессии гена mdr1, так и увеличение дозы гена – амплификация участка генома, содержащего ген mdr1, и еще пяти или шести сцепленных с ним генов.

Активность  Pgp может быть оценена по степени накопления меченного лекарства (например,  ³Н-винбластина) или флуоресцирующего препарата (например, даунорубицина) клетками, а также по степени накопления или по скорости выброса веществ, например, флуоресцентных красителей, субстратов для Pgp (родамина-123). 

С помощью  гибридизации нуклеиновых кислот показано, что селекция клеток китайского хомячка CHLV-79 RJK на устойчивость к бромистому этидию приводит к амплификации и экспрессии генов семейства mdr, один из которых кодирует трансмембранный Р-гликопротеин, ответственный за понижение содержания БЭ в клетках. Авторы полагают, что амплифицированные копии генов mdr  локализуются в тех же участках генома, где локализованы гены mdr дикого типа, и морфологически выявляются в виде гомогенно окрашенной области одной из хромосом, производной хромосомы 1. Полученные данные свидетельствуют о том, что устойчивость клеток CHLV-79 RJK к бромистому этидию в возрастающих концентрациях достигается в результате как амплификации генов mdr, так и регуляции экспрессии этих генов.

В другой работе в результате многоступенчатой селекции клеток китайского хомячка CHO-K1 на устойчивость к бромистому этидию были получены устойчивые сублинии Cerb-1 и Cerb-2. Показано, что клетки Сerb-1 и Cerb-2 характеризуются множественной лекарственной устойчивостью. С помощью гибридизации нуклеиновых кислот в клетках Cerb-2 обнаружены амплификация и повышенная экспрессия генов семейства mdr. В результате слияния клеток Cerb-2 с клетками китайского хомячка линии CHLV-79 RJK, чувствительными к БЭ, были получены два гибридных клона Hyrb-1 и Hyrb-2. Клетки Hyrb-2характеризовались такой же устойчивостью к БЭ, как и клетки Cerb-2, у клеток Hybr-1 она оказалась ниже. В клетках Hyrb-2амплификация и экспрессия генов mdr не отличались от таковых у клеток Cerb-2. В клетках Hyrb-1 амплификации этих генов не обнаружено, хотя уровень экспрессии оказался выше, чем в чувствительных клетках. На основании полученных данных можно предположить, что устойчивость клеток китайского хомячка к БЭ обусловлена амплификацией и повышенной экспрессией генов mdr.

В работе Гринчук и сотрудников исследованы кариотипы клеток китайского хомячка линии CHLV-79RJK и 6 сублиний этих клеток, отобранных на устойчивость к возрастающим концентрациям бромистого этидия, а также количество копий генов mdr в клетках, чувствительных и устойчивых к БЭ. Показано, что устойчивые к БЭ сублинии характеризовались МЛУ. Авторы предполагают, что амплификация генов mdr в устойчивых к БЭ клетках CHLV-79 RJK может рассматриваться как фактор, инициирующий последующую дестабилизацию генома и приводящий в итоге к изменениям в структуре кариотипа.

В настоящее  время хорошо известно, что при  ступенчатой селекции на устойчивость к некоторым цитотоксическим  агентам (растительным алкалоидам и  антибиотикам) клетки опухолевых линий in vitro приобретают перекрестную устойчивость к целому ряду цитостатиков, различающихся как по структуре и происхождению, так и по воздействию на разные клеточные мишени. Спектры препаратов, к которым развивается перекрестная устойчивость, а также механизмы, ее обеспечивающие, могут различаться в зависимости от выбора селективного агента.

Исследования  генов и путей сигнальной трансдукции, вовлеченных в регуляцию активности Р-гликопротеина, свидетельствуют о  том, что данных путей может быть несколько. Так, с использованием введения в клетку промоторной области гена mdr1 в составе конструкции, содержащей ген–репортер, а также в условиях стабильной трансфекции некоторых других генов было показано, что на активность промотора mdr1 или эндогенного гена клеток могут влиять гены р53, ras, raf  и гены рецепторов ретиноевой кислоты (RARα и RARβ). На активность гена mdr1 влияют также гены транскрипционных факторов c-fos и c-jun, для которых имеются респонсивные элементы в промоторной области гена mdr1.

В регуляции  активности Р-гликопротеина принимают  участие протеинкиназа С, протеинкиназа А и, возможно, еще некоторые протеинкиназы. Так, в работе Некрасовой изучалась активность протеинкиназы С в клетках клонов линии CHO-K1, устойчивых к бромистому этидию в концентрациях 1 и 10 мкг/мл. Было обнаружено, что в клетках устойчивых клонов, отличающихся по пролиферативным характеристикам как друг от друга, так и от клеток исходной популяции, активность протеинкиназы С на первом этапе селекции увеличивалась во фракции мембран, а при дальнейшем увеличении устойчивости возрастала как в мембранах, так и в цитозоле. Культивирование устойчивых клеток в присутствии бромистого этидия приводило к увеличению активности фермента.

В опытах с культивируемыми клетками было показано, что процесс, связанный  с развитием и становлением МЛУ, может сопровождаться изменениями  в клеточной морфологии и физиологии: в частности, изменяются распластываемость клеток, скорость их размножения, внутриклеточный мембранный транспорт, опухолеродность и метастатическая активность резистентных клеток.  

Показано, что бутират натрия, гемин, 1-β-D-арабинофуранозилцитозин и эритроидный фактор дифференцировки (EDF) индуцируют эритроидную дифференцировку как в резистентных к винкристину клетках К562, так и клетках родительской линии. Уровень экспрессии mdr-гена в сублинии уменьшался после обработки EDF, но не после воздействия других индукторов. Следовательно, EDF регулирует функцию Р-гликопротеина в винкристин-резистентных клетках. Более того, EDF повышал чувствительность клеток сублинии к агентам множественной лекарственной устойчивости и подавлял экспрессию Р-гликопротеина. Было также показано, что линия К562, резистентная к винбластину, была кросс-резистентна к доксорубицину и этопозиду, но оставалась чувствительной к цитозинарабинозиду, 6-тиохинолину.  При этом MDR-фенотип не влиял на уровень синтеза гемоглобина в ответ на гемин, но увеличивал способность клеток дифференцироваться при обработке цитозинарабинозидом. Полученные результаты свидетельствуют, что индуцированная дифференцировка необходима в преодолении MDR-фенотипа. 

3. Использование гена метилгуанин метилтрансферазы.

Ген – MGMT –  кодирует фермент метилгуанин-метилтрансферазу, удаляющий мутагенные и цитотоксические алкильные аддукты из молекул ядерной ДНК. Опухоли, в которых не экспрессируется MGMT, характеризуются повышенной частотой точечных мутаций в генах, кодирующих белки р53 и К-ras. Кроме того, показано, что дефицитные по MGMT опухоли отличаются более высокой чувствительностью к химиотерапевтическим алкилирующим агентам.

Есть много  исследований, которые изучали различную  лекарственную устойчивость в естественных условиях для выбора стратегии обогащения, среди которых, наиболее эффективная  стратегия использует ген-опосредованной резистентности О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансферазы (MGMT) (P140K). MGMT (P140K), который является мутантной формой гена MGMT лекарственной устойчивости. MGMT имеет возможность восстановить, вызванное химиотерапией алкилирование ДНК, тем самым делая химиотерапевтические препараты неэффективными для лечения рака. Применение O6 бензилгуанина (O6BG) в комбинации с химиотерапией приводит к торможению MGMT, делая химиотерапевтические препараты более эффективными. Стратегия обогащения MGMT (P140K)-опосредованных донорских стволовых клеток опирается на комбинированние цитотоксического действия алкилирующей химиотерапии плюс O6BG на эндогенные стволовые клетки хозяина и лекарственную устойчивость пересаженных клеток, экспрессирующих MGMT (P140K). Это стратегия была продемонстрирована для достижения 75% -100% приживления донорских клеток.

Существует искусственный  блокатор MGMT – препарат белзингуанин, способный вернуть чувствительность клеток к химиотерапии. Однако токсический эффект данного средства совместно с химиотерапией настолько силен, что вызывает подавление костного мозга. Применив трансплантацию стволовых клеток, ученым удалось полностью исключить повышенную токсичность, тем самым снижая количество побочных эффектов, а также сохранить чувствительность клеток к химиотерапии.

4. Использование гена глутатион S-трансферазы.

Глутатион S-трансфераза (GST) это ферментативная система, вовлеченная в клеточную детоксикацию. Глутатион (GSH) - небелковый тиол, взаимодействие сульфгидрильной группы которого с реактивной группой лекарственного препарата, определяет образование конъюгатов препарата с глутамином. Эти конъюгаты менее активны, растворимы и выбрасываются из клетки с помощью белков транспортеров GS-X, в том числе MRP [9]. Химические взаимодействия между глутатионом и алкилирующими соединениями катализируются группой ферментов GST, разные изоформы которых взаимодействуют с разными препаратами, повышая степень детоксикации лекарств.

GST вовлечен в метаболическую биотрансформацию многих противоопухолевых лекарств, он также защищает клетки от разрушения вследствие действия свободных радикалов. Существует несколько клеточных линий с гиперэкспрессией GST. GST-тс изофермент, который гиперэкспрессирован в клетках рака молочной железы, устойчивых к адриамицину MCF7/ADR, эти клетки также экспрессируют P-gp. Увеличение уровня GST-Ti также наблюдается в разных клеточных линиях с МЛУ. Другие GST изоформы в 8 раз увеличивают резистентность к лекарствам, таким как хлорамбуцил. Такие агенты, как этакриновая кислота и простагландин являются блокаторами GST активности. Они могут быть использованы для увеличения чувствительности к хлорамбуцилу или мелфалану.

GST является  клеточным регулятором тиол трипептида. Глутатион также играет ключевую роль в детоксификации и клеточной репарации после разрушающего эффекта доксорубицина и алкилирующих агентов [НО]. Увеличение уровня GSH наблюдается во многих клеточных линиях, резистентных к алкилирующим агентам. Уменьшение уровня GSH приводит к повышению чувствительности клеток с лекарственной резистентностью. Использование таких агентов, как бутатионин сульфоксамин (BSO) снижает GSH-опосредованную лекарственную резистентность, путем уменьшения GSH уровней.

Таким образом, глутатион является компонентом для ряда ферментов,  которые играют важную роль в защитной системе организма. Многие типы опухолей содержат много глутатиона, что позволяет злокачественным клеткам повысить сопротивляемость к химио- и радиотерапии. Тем не менее процессы регуляции метаболизма глутатиона в опухолевых клетках нарушены, и использование в данном случае лекарственных препаратов направленного действия в комбинации с цитостатиками может повысить эффективность антиопухолевой терапии.

5. Другие гены (aldh, cdd, mrp1).

ALDH вызывает гиперпродукцию ретиноевой кислоты, которая, в свою очередь, связывается с ядерными рецепторами клеток и влияет на экспрессию многих генов – в частности, генов, участвующих в регуляции выживания клетки, ее репарации и пролиферации. Объединенное действие этих генов делают клетку устойчивой к химиотерапии. Отсюда вывод: сделайте мишенями лекарственного препарата клетки с высоким уровнем ALDH и мишенями станут все производимые им эффекты, включая влияние на сигнальный путь ретиноевой кислоты.

Пересадив модельным  животным ALDH+ и ALDH- клетки меланомы, ученые установили, что ALDH+ варианты проявляют  гораздо большую туморогенность. В культуре ALDH+ клетки с подавленным геном, кодирующим этот белок, погибали, а в организме модельных животных теряли свою способность к образованию опухолей. Кроме того,  in vitro подавление гена ALDH повышало чувствительность клеток к существующим методам химиотерапии. При изучении образцов человеческих опухолей были обнаружены субпопуляции ALDH+ клеток, составлявшие около 0,1-0,2 процента первичной опухоли. В образцах метастатической меланомы – наиболее агрессивной формы заболевания – процент ALDH+ клеток был выше, в некоторых случаях даже более 10 процентов, что подтверждает особую опасность этих клеток.

В этих же клетках  наблюдается активация маркеров стволовых клеток и подавление маркеров дифференциации. Кроме того, ALDH+ клетки дают начало гетерогенным типам клеток, наблюдаемым в первичной опухоли, что означает, что, помимо способности  к самообновлению и туморогенности, эти клетки отвечают третьему критерию раковых стволовых клеток – способности к дифференциации.