Генотерапия раковых заболеваний

 

Белки цинковый палец взаимодействуют через  их индивидуальные пальцев до трех пар оснований дочерних сайтов на ДНК-мишени. Четыре ключевых  Остаток позиции -1, 2, 3 и 6 на альфа-спирали цинковых пальцев у водородных связей взаимодействия с ДНК.

Mutating этих ключевых остатков позволяет генерировать множество комбинаторных возможностей, которые можно привязать к любому ДНК растянуть интерес. Используя привязку специфичность и аффинность взаимодействия между цинковых пальцев и соответствующих ДНК может помочь создать инженерных пальцы цинка в терапевтических целях с участием генома ориентации. Изучение структурно-функциональных отношений существующих цинковый палец-ДНК может помочь в прогнозировании.Вероятно пальцы цинка, который может связываться с любым ДНК-мишени. Вычислительных средств облегчить прогнозирование таких инженерных

цинковых  пальцев путем эффективного использования  информации из имеющихся экспериментальных  данных.

 

 

II. Прямое убийство раковых клеток.

 

1. Использование генов-самоубийц, генов, кодирующих потенциально токсические для раковых клеток молекулы или генов, кодирующих промоторы апоптоза.

Терапия, инициирующая апоптоз опухолевых клеток. Апоптоз клетки можно

запустить с  помощью многих факторов. Например, апоптоз можно вызвать, усилив

чувствительность  клетки к повреждениям ДНК. Этому  способствует введение

генетических  конструкций, усиливающих или запускающих  подавленную или полностью отсутствующую  в опухолевых клетках экспрессию клеточных белков (р53, E2F-1). К запуску самоубийства клеток приводит введение непосредственно

проапоптотических генов - генов, кодирующих предшественников каспаз; генов, чьи продукты блокируют ингибиторы апоптоза (IAP); генов, кодирующих участников митохондриального пути апоптоза (Apaf-1, Bax).

Введение  в опухолевую массу лигандов для  мембранных рецепторов апоптоза приводит опухолевые клетки к гибели. Наилучшие результаты в доклинических исследованиях получены при использовании рекомбинантного лиганда TRAIL, который, в отличие от Fas-лиганда и TNF-a, не оказывал токсичного действия на окружающие ткани.

Часто многие опухолевые клетки имеют пониженную экспрессию рецепторов апоптоза, в частности DR4-рецепторов для TRAIL. Поэтому генную терапию с помощью TRAIL предваряют терапией, способствующей повышению экспрессии DR4-рецепторов (повышенная экспрессия р53, блокада ингибиторов апоптоза IAP и Smac/Diablo).

Большинство опухолей устойчивы к действию цитотоксических препаратов. Одной из составляющих, способствующему этому, а также препятствующему запуску апоптоза, является каскад реакций, индуцированный фактором транскрипции NF-kB. Поэтому была разработана соответствующая генная терапия протеолитически стабильным «суперрепрессором» этого каскада IkB, который повышает чувствительность некоторых видов опухолей к химиотерапии, TNF-a. Подобный эффект оказывают ингибиторы протеасом, протеинкиназы С.

Одним из важных подходов в рамках апоптозной стратегии генной терапии является «суицидальная» GDEPT-терапия (gene directed enzyme prodrug therapy). Эта терапия способствует повышению чувствительности раковых клеток к апоптозу с помощью нетоксичных предшественников противоопухолевых препаратов.

Апоптоз пролиферирующих клеток можно вызвать  с помощью препарата ганцикловир, который оказывает токсичное действие на быстроделящиеся клетки. Он представляет собой активированный продукт гена тимидинкиназы вируса простого герпеса. Для апоптоза опухолевых клеток их сначала заражают вирусом простого герпеса, несущего ген тимидинкиназы, а затем через некоторое время вводят ганцикловир. Тимидинкиназа вируса фосфорилирует ганцикловир.

Киназы клетки-хозяина присоединяют к фосфорилированному ганцикловиру

трифосфат, а трифосфаты затем включаются во вновь синтезированную ДНК в процессе синтеза ДНК при клеточном делении. Включившись, они обрывают дальнейший синтез ДНК, терминируют его, что приводит к запуску апоптотических сигналов. В результате клетки, содержащие герпесную тимидинкиназу, погибают в присутствии этих агентов.

Через межклеточные контакты ганцикловиртрифосфат может попасть в другие опухолевые клетки и привести к их гибели.

Подобные  эксперименты вначале велись на животных моделях. Клетки мышиных

фибробластов, продуцирующие рекомбинантные ретровирусы подсаживались прямо в опухоль в мозге. Рекомбинантные ретровирусы содержали ген HSVtk. Поскольку ретровирусы интегрируют в митотически активные клетки, ген тимидинкиназы оказывался преимущественно в опухолевых клетках, тогда как здоровые клетки из тканей, окружающих опухоль, оставались вне вирусной атаки и, следовательно, без гена тимидинкиназы герпеса.

Фосфорилированный ганцикловир может диффундировать от клеток, в которых он образуется за счет работы вирусной тимидинкиназы, к соседним клеткам. Если соседние клетки делятся, то они будут его включать в состав ДНК и погибать. Экспериментально показано, что если 10% клеток опухоли содержит ген тимидинкиназы, то опухоль может быть уничтожена полностью. И при этом у животных не наблюдается токсических эффектов.

Полученные  результаты позволили начать испытания  на больных раком мозга, которым  инъецируют мышиные фибробласты, продуцирующие  рекомбинантные ретровирусы, содержащие ген HSVtk, а затем внутривенно вводили ганцикловир.

 

2. Использование генов, кодирующих опухолевые суппрессоры.

 

Направленное убийство опухолевых клеток. Это может осуществляться путем

введения  генов, кодирующих токсины под контролем  промоторов, специфически

экспрессирующихся в опухолевых клетках. Например, гена, кодирующего дифтерийный токсин.

Другой недавно  разработанный генотерапевтический подход заключается в использовании штамма аденовируса, кодирующего дефектный белок Е1В. Этот белок с молекулярной массой 55 кДа в обычных условиях обладает сродством к одному из основных онкосупрессоров р53. При взаимодействии с ним он блокирует его действие. В результате генетического дефекта Е1В в сайте взаимодействия с р53 при попадании в нормальные клетки не происходит нарушения активности р53 и дальнейшего развития вируса. Большинство опухолевых клеток несет мутации именно в гене, кодирующем белок р53, поэтому при попадании аденовируса в эти клетки блокады репликации аденовируса не происходит. Вирус размножается и осуществляет свое цитопатическое действие. Этот подход был отработан на животных моделях и в настоящее время

используется  в клинических целях, обычно в  сочетании с дополнительной химиотерапией.

Для восстановления нормального фенотипа осуществляют блокаду экспрессии онкогенов с помощью внутриклеточной иммунизации, например, путем введения в клетки конструкций, программирующих синтез антисмысловых РНК или антител к онкобелкам. Ведутся исследования по использованию внутриклеточных антител для инактивации рецепторов ростовых факторов, которые вовлекаются в опухолеобразование. К числу таких рецепторов относится ErbB2. Он принадлежит к семейству рецепторов эпидермального ростового фактора EGFR. Функционально это семейство представляет собой семейство рецепторов с тирозинкиназной активностью, которая имеет ключевое значение для регуляции жизнедеятельности клетки. Этот рецептор повышенно экспрессируется на клетках ряда опухолей (карцинома яичника, молочной железы). На культурах клеток продемонстрировали, что внутриклеточные антитела к этому рецептору, заякоренные в эндоплазматическом ретикулуме, предотвращали его появление на поверхности клеток и приводили к приостановке клеточной пролиферации. Наблюдали и обращение трансформированных клеток к нетрансформированному фенотипу.

Использовали, в частности, антитела против продукта гена ras. Это p21ras белок, связывающий гуанозиннуклеотиды и вовлеченный в многочисленные процессы контроля клеточного роста и дифференцировки. Введение в опухолевые клетки генов онкосупрессоров, таких как p53, также способствует восстановлению нормального фенотипа опухолевых клеток.

 

4). Использование цитотоксических лимфоцитов

были использованы Т-лимфоциты, инфильтрующиеся в опухоль (ТИЛ). ТИЛ брали у онкологических пациентов и с помощью ретровирусного вектора вводили в них ген устойчивости к неомицину. Модифицированные ТИЛ растили в культуре в присутствии фактора роста Т-лимфоцитов IL-2. Затем Т-лимфоциты вводили пациентам.

Клинические исследования показали безвредность введения генетически модифицированных Т-лимфоцитов. Однако, осталось неясным, насколько специфично лимфоциты мигрируют в опухоль.

Дальнейшие  эксперименты велись также с ТИЛ, но в качестве терапевтического гена брали ген, кодирующий фактор некроза  опухолей (ФНО). ФНО представляет лимфокин, который оказывал сильный противоопухолевой эффект, что было подтверждено в опытах на мышах. Однако, при экстраполировании этих экспериментов на человека, введение ФНО оказывалось очень токсичным для организма в целом. Но несмотря на первые неудачи, клинические испытания с использованием ТИЛ для генной терапии опухолей активно ведутся вплоть до настоящего времени, также как и дискуссии на тему эффективности такого подхода.

Другой подход предполагает изменение функционирования клеток-эффекторов при

помощи генов, кодирующих химерные рецепторы. Такие  рецепторы включают

вариабельные  домены противоопухолевых моноклональных антител и константные

участки цепей  Т-клеточного рецептора. При экспрессии таких рецепторов распознавание опухоли и последующая активация цитотоксических Т-клеток не зависят от антигенов гистосовместимости.

Еще одно направление  связано с клонированием и  размножением ex vivo Т- лимфоцитов, несущих гены, которые кодируют Т-клеточные рецепторы, направленные против опухолевых антигенов.

 

III. Непрямое убийство раковых клеток

1. Пассивная иммунотерапия
1. Использование вакцин на основе БЦЖ

Один из эффективных  методов — это внутрипузырная БЦЖ-терапия. Вакцина БЦЖ — это взвесь жизнеспособных бацилл КальметтаГерена (Calmette-Guerin). Внутриклеточно размножаясь, они стимулируют местный иммунитет, в котором задействованы макрофаги, Т-лимфоциты и цитокины. В 20 исследованиях, проведенных с использованием различных форм поддерживающей БЦЖ-терапии, отмечено снижение шансов прогрессирования рака на 37 %. Более того, клинически доказано, что вакцина БЦЖ более эффективна по сравнению с митомицином С.

БЦЖ - это  вакцина, приготовленная на основе бактерии Mycobacterium bovis, которая вызывает туберкулез у крупного рогатого скота. Для человека БЦЖ не опасна, но обладает способностью активировать иммунитет. Вакцина БЦЖ действует наподобие цитокинов, усиливая работу всей иммунной системы. Непосредственно на клетки меланомы вакцина не влияет. Иногда она используется при лечении меланомы стадии III и вводится в саму опухоль.

2. использование иммуностимуляторных цитокинов (интерлейкин -2, интерлейкин-4, интерлейкин-12;  интерферон альфа, бэта, гамма;  фактор некроза опухолей альфа,  GM-CSF)

Добавление  других цитокинов, например IL-4, IL-13, IL-15 или TNF-, противодействовало эффектам выделения, связанным с активацией этих клеток. Использование на практике способов данного изобретения обеспечивает простой и более экономичный  способ получения и поддержания  незрелых дендритных клеток с состоянии, оптимизированном для поглощения, процессинга и презентации выбранного антигена.

Новые гены можно внедрить в клетки с тем, чтобы на их поверхности экспонировались  новые белки. Новые белки включают иммунную сигнализацию и стимулирование молекул, например, такого цитокина, как  интерлейкин-2, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) и других стимулирующих молекул. Генетически-измененные вакцины опухолевых клеток создают клетки, которые синтезируют опухолеспецифические антигены, так же как и новые иммуностимуляторные молекулы на их клеточной поверхности. Эти клетки могут быть введены пациенту. Комбинация молекул на поверхности ведет к усиленному иммунному ответу. Добавленные молекулы на поверхности измененных опухолевых клеток стимулируют иммунную систему, чтобы атаковать даже те клетки опухоли, которые остались в организме и не имеют новых белков на своей поверхности.

интерлейкины – это цитокины, которые организм производит естественным образом, и которые можно получить в лаборатории. Определены многие интерлейкины. Применение интерлейкина-2 (альдеслейкина) в лечении рака наиболее изучено. Интерлейкин-2 стимулирует рост и активность многих иммунных клеток, таких как лимфоциты, которые разрушают раковые клетки. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило применение интерлейкина-2 для лечения метастатического рака почки и метастатической меланомы.  

Интерлейкин-2 (ИЛ-2) применяют через 10-14 суток после  введения вакцины в дозе 100000-125000 МЕ на м2 поверхности тела в день, внутривенно капельно, в течение 4 часов. Курс лечения состоит из 15-60 введений. Затем проводят поддерживающую иммунотерапию ИЛ-2 в течение 6-12 месяцев, с интервалом 2 месяца. ИЛ-2 вводят ежедневно, 4 дня, в дозе 125000 МЕ на м2.

Гамма-интерферон (ИФН-γ) применяется по следующей схеме: внутримышечное введение 1000000 МЕ ИФН-g через день – 1 месяц, затем 2 месяца – 1 раз в неделю. Гамма-интерферон начинают вводить через день после инъекций вакцины РЕСАН.

Если есть возможность во время основного  курса иммунотерапии доставлять ИЛ-2 и ИФН-γ непосредственно к опухоли, то это наиболее предпочтительный вариант.