Генотерапия раковых заболеваний

Высокопроизводительная  технология электрослияний, используя дендритные и различные мышиные и человеческие опухолевые клетки, способна давать хороший выход эффективных гибридов (15-54%) (Kuriyama et al 2004). Полученные клетки демонстрируют фенотип зрелых дендритных клеток и экспрессируют опухоль-ассоциированные антигены. В преклинических испытаниях на животных модели меланомы B16, трансдуцированной геном LacZ, однократная вакцинация мышей с опухолями, локализованными в лёгких, коже и мозге, привела к опухолевой регрессии и улучшению их выживаемости. Терапевтическая эффективность DCs гибридной вакцины сейчас оценивается в лечении пациентов с метастатической меланомой.

 Генетически модифицированные дендритные клетки

 При создании DCs-вакцин может быть использована  генная инженерия. Получаемые  in vitro дендритные клетки трансдуцируют генами, кодирующими опухолеспецифические антигены либо схожие с ними антигены или пептиды. Такие клетки могут быть использованы для индукции цитотоксического Т-клеточного ответа. Генно-инженерные  технологии для эффективного генного переноса используют рекомбинантные вирусные векторы, неспособные к репликации. Но наличие на мембране дендритных клеток вирусных (и поэтому чужеродных) антигенов кроме возможности усиления иммунного ответа несёт вероятность ускоренной элиминации этих клеток при последующих курсах иммунизации вследствие развития противовирусного иммунитета к обработанным таким образом дендритным клеткам. Один из способов преодоления этого - использование вирусных векторов, которые не приводят к презентации продуктов вирусных генов на поверхности клетки. Это такие векторы, как ретровирусные или «ослабленные» аденовирусные. Лентивирусы также могут использоваться в приготовлении DCs вакцин, но пока сведений об их использовании в доклинических испытаниях на животных нет. Перед ретровирусами у лентивирусов есть преимущество в том, что для эффективной трансдукции им не требуется репликация В-клетках-мишенях. Преимущество аденовирусов в том, что они обладают малой иммуногенностью за счёт малого количества вирусных эпитопов. В работе Ribas (Ribas et al 2002) обобщаются результаты 52 преклинических исследований противоопухолевых генетически-модифицированных DCs вакцин и представляется информация об оптимальных методиках генного переноса в дендритные клетки, алгоритме введения и механизмах последующего противоопухолевого эффекта. Эти данные смогут помочь выходу этих методов в клинику.

Будущее развитие DCs вакцин

DCs вакцины представляются наиболее перспективными среди всех противоопухолевых вакцин. В будущем DCs-клеточные вакцины будут включать использование моноклональных антител, генетическое модифицирование DCs, применение СВ-34+ предшественников, и станет возможной адресная доставка DCs к опухоли, использование лизатов опухоли или апоптозных клеток как источников дополнительных ещё не идентифицированных опухолевых антигенов.

При обработке  DCs комплексами моноклональных антител к ассоциированному с 1 комплексом гистосовместимости опухолевой клетки протеину А и самим этим протеином (он широко представлен во многих, если не всех, типах опухолевых клеток и практически не представлен в нормальных тканях), удаётся значительно усилить перекрёстную антигенпрезентацию опухолевых антигенов и инициировать поливалентный противоопухолевый CD8 и CD4 Т-клеточный ответ (Groh et al 2005). Это в значительной степени увеличивает силу иммунной реакции при сравнении с реакцией от индукции такого ответа иными агентами. Эти результаты стимулируют развитие DCs вакцин, предлагают основу для Т-клеточной терапии и продолжения исследований опухолевых антигенов.

Для увеличения нагруженности DCs онкопротеинами при манипуляциях in vitro и улучшения эффективности вакцин было предложено множество способов генетических коррекций и на экспериментальных опухолях показана их эффективность. DCs трансфецировали либо полинуклеотидами (ДНК или РНК), кодирующими опухолеспецифичные антигены либо ДНК, кодирующими иммуностимулирующие цитокины и ко-стимулирующие молекулы. Доставка в дендритные клетки генов, кодирующих антигенные эпитопы или другие молекулы, осуществляется рекомбинантными ретровирусами, аденовирусами, поксвирусами. Как альтернатива используется слияние дендритных клеток с опухолевыми, и у пациентов с онкологическими заболеваниями получаемые вакцины показывают высокую эффективность.

Мобилизация большего числа дендритных клеток или  их предшественников и автоматизация  культуральных процессов может увеличить эффективность получаемых DCs вакцин.

Сочетание новых  мощных инструментов иммуномониторирования с усовершенствованием протоколов DCs вакцинации (плюс рационально выстроенные фундаментальные научные исследования) обеспечит большее доверие к противоопухолевой терапии и новые возможности лечения для онкологических больных.

3. Антиангиогенная терапия

Антиангиогенная терапия

Терапия, направленная прямо на ингибирование неоангиогенеза, получила название антиангиогенной. Этот терапевтический подход очень привлекателен, так как, во-первых, эндотелиальные клетки непосредственно контактируют с кровью, во-вторых, они являются нормальными клетками и, таким образом, не становятся резистентными к длительному лечению. Кроме того, разрушение лишь небольшой части сосудов ведет к некрозу опухоли большого объема.

Антиангиогенную активность имеют более 200 соединений. Большинство из них показали свою активность в одном из наиболее широко используемых тестов на хорионаллантоиднои мембране цыпленка. Однако значительное количество субстанций было найдено при изучении отдельных этапов ангиогенеза и поиске их ингибиторов. Примером последнего пути могут служить ингибиторы матриксных металлопротеиназ -  батимастат и маримастат .

 По механизмам  действия все антиангиогенные вещества, проходящие клинические испытания, могут быть разделены на две большие группы [ Bicknell ea 1996 ]:

1) ингибирующие  передачу ангиогенных сигналов эндотелиальным клеткам (антагонисты факторов роста эндотелия, ингибиторы продукции ангиогенных факторов, миграции эндотелиальных клеток);

2) ингибирующие пролиферацию эндотелиальных клеток. Наиболее перспективны такие антиангиогенные препараты, как маримастат, батимастат,  SU 6661 и др.

 В заключение  следует отметить, что определение  и исследование биологических  характеристик ангиогенеза опухолей может иметь важнейшее значение не только для лучшего понимания причин развития первичной опухоли и метастазов, но и для лучшего планирования лечения. За последнее время наши знания о биологических процессах, вовлеченных в формирование новых микрососудов, сильно возросли. И хотя прогностические, предсказывающие и терапевтические принципы еще только формируются, достижения в понимании патофизиологии ангиогенеза передаются в клиническую практику и, возможно, в не столь далеком будущем оценка ангиогенеза будет использована в рутинной клинической практике.

В общем о непрямом убийстве клеток

Увеличение иммуногенности опухолевых клеток, например, путем введения генов, кодирующих продукты, обеспечивающие распознавание опухоли клетками иммунной системы (цитокиновых генов, генов, кодирующих главный комплекс гистосовместимости и др.). Небольшое число попыток генотерапии злокачественных опухолей связано с введением в клетки опухоли генов IL-2 или ФНО. Затем эти клетки вводили в организм больного, что обеспечивало иммунологическую реакцию на опухолевые клетки. Такие манипуляции проводили для лечения больных злокачественной меланомой, раком почки.

Проводятся  работы по введению в опухолевые клетки генов, кодирующих белки-

иммуностимуляторы. Клетки выращивают в культуре, затем  облучают и вводят обратно пациенту в надежде вызвать системный  иммунный ответ. Он, с одной стороны, уничтожает уже существующие опухолевые клетки, а с другой - предохраняет от возникновения новых опухолей данного типа. Повышение концентрации цитокинов в непосредственной близости от опухолевых клеток стимулирует мигрирующие  в опухолевый очаг Т-клетки. Стимулирующие  эффекты наблюдались как у  опытных животных, так и у пациентов-волонтеров, получивших такую терапию.

Представленные  исследования дали начало развитию нового направления

противоопухолевой терапии – терапии с применением индивидуальных

противоопухолевых вакцин. Первые эксперименты проводились на мышах. Клетки опухолей трансформировали генами таких цитокинов, как: IL1-1, IL-2, IL-4, IL-6, TNF-a, GM-CSF, гамма-интерферон. Наблюдали, что у животных, которым вводили генетически модифицированные опухолевые клетки, происходило торможение опухолевого роста. В ряде случаев животные становились невосприимчивыми к возникновению новых опухолевых очагов при введении немодифицированных опухолевых клеток. Таким образом, трансдуцированные клетки действовали, как противоопухолевые вакцины. Это послужило основанием для испытания подобных подходов на людях.

В настоящее  время предпринимаются попытки  «включать» гены цитокинов с помощью  ретровирусных векторов в клетки меланомы, различных карцином, нейробластомы, рака груди.

Другой подход в создании противораковых индивидуальных вакцин заключается в следующем. Ранее считалось, что для узнавания  и последующей иммунной реакции  достаточно только взаимодействия Т-клеточного рецептора и комплекса пептида с молекулами HLA I класса. Оказалось, что для полноценного иммунного ответа необходимо наличие дополнительного сигнала. Этот сигнал образуется путем взаимодействия молекулы В7 на поверхности антигенпредставляющей клетки и ее рецептора на поверхности Т-клетки, называемого CD28 антигеном.

Причиной  того, что опухолевые клетки не узнаются клетками иммунной системы

может быть то, что они обычно не экспрессируют на поверхности В7. В связи с этим были предприняты попытки стимулировать противоопухолевый ответ путем введения гена В7 в опухолевые клетки. Подобным образом были модифицированы меланомные мышиные клетки. Их введение мышам с меланомой приводило к деградации опухоли, и ни одна из мышей, получивших дозу клеток модифицированной меланомы, не погибла. Более того, если мышам, вакцинированным модифицированными меланомными клетками, вводили

немодифицированные клетки меланомы, то 89% мышей оказывались защищенными от развития опухоли. Это означает, что вакцина способна защищать от метастазирования.

Еще один потенциальный  способ противоопухолевой терапии  связан с блокадой

механизмов, с помощью которых опухолевые клетки избегают уничтожения клетками иммунной системой. Многие опухоли  синтезируют большие количества

инсулинподобного ростового фактора - IGF-1. Экспрессию этого гена можно подавить путем введения в опухолевые клетки генетических конструкций, кодирующих антисмысловую РНК, т.е. РНК, комплементарную по отношению к мРНК гена IGF-1. Такая РНК взаимодействует с мРНК этого ростового фактора и препятствует ее трансляции. Опухоли, образуемые такими модифицированными клетками, разрушаются иммунной системой.

IV. Защита нормальных клеток от агрессивной химиотерапии и радиотерапии.

1. Использование мутантного варианта дифолатредуктазы.
2. Использование генов множественной лекарственной резистентности (типа mdr1).

Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) – это невосприимчивость клеток или организма одновременно к целому ряду лекарственных препаратов разного химического строения и с разным механизмом действия. Она определяется как снижение чувствительности до такой степени, что клетки способны размножаться при воздействии на них препарата в критической или более высокой концентрации. Развитие МЛУ к используемым лекарственным препаратам является одним из проявлений фундаментального биологического свойства всех живых организмов – приспособления к изменениям условий внешней среды. Исследования последних лет показали, что молекулярные механизмы МЛУ множественны, и лекарственная устойчивость может определяться включением различных биологических систем, характеризующих разные этапы осуществления токсического действия химиопрепарата – от ограничения накопления лекарства внутри клетки до отмены программы гибели клеток, индуцируемой веществом. Нередко в клетке включается несколько защитных механизмов, однако чаще всего преобладает какой-то один механизм. Наиболее изученными механизмами, клиническая значимость которых при определенных формах новообразований установлена, являются: активация трансмембранных транспортных белков, выводящих различные вещества из клетки (в частности, Р-гликопротеина – Pgp); активация ферментов системы глутатиона, детоксифицирующей препараты; изменения генов и белков, контролирующих апоптоз и выживаемость клеток. Существует тесная взаимосвязь количественных изменений клеточной популяции и изменений их биологических свойств, одним из которых является лекарственная устойчивость. В активно размножающейся популяции всегда имеется некоторое количество лекарственно-устойчивых мутантов, которые практического значения не имеют, но по мере сокращения популяции, например под влиянием химиотерапевтических препаратов, изменяется соотношение между количеством лекарственно-чувствительных и лекарственно-устойчивых клеток. В этих условиях происходит размножение главным образом лекарственно-устойчивых клеток, их количество неуклонно возрастает. Итогом такой клональной селекции является поликлоновость опухоли и доминирование наиболее агрессивных клонов. В связи с этим целью настоящего обзора является обобщение данных по основным механизмам развития МЛУ опухолевых клеток при воздействии различных химиопрепаратов.