Генотерапия раковых заболеваний

I. Реверсия ракового фенотипа.

1. Замена мутантной аллели гена на нормальную копию.

Впервые попытка  генной терапии в клинике была предпринята М.Клайном в 1983 году., когда им было осуществлено введения нормального бета-глобинового гена больным бета-талассемией. Позднее была разработана методика генной терапии наследственной недостаточности аденозин-деаминазы (тяжелый иммунодефицит): нормальный ген был введен в клетки костного мозга больного и после их ретрансплантации восстановилась активность фермента, состояние больного улучшилось. Проведены клинические эксперименты по генотерапии рака. В лейкоциты больных злокачественной меланомой и поздними стадиями рака были введены гены, маркирующие злокачественные клетки (чтобы их могла узнавать имунная система). У половины больных размеры опухолей уменьшились в два раза и более.

- клетки  остеосаркомы имели мутации в гене Rb1; введение кДНК нормального гена Rb1 в эти клетки в культуре вызывало их реверсию;

- в раковые  клетки также в культуре вводился  нормальный ген wt53; под его  действием раковые клетки теряли  свойства ракового фенотипа. Из  работы не ясно, насколько стабильна  реверсия раковых клеток в  этих опытах.

2. Перенос в раковые клетки нормальной аллели гена в случае мутации с потерей функции.

3. Подавление экспрессии мутантной аллели гена в случае доминантно-негативной мутации.

3.1) Использование антисмысловых ДНК и РНК олигонуклеотидов.

Антисмысловая РНК— получаемый искусственно или природный полирибонуклеотид, комплементарный определенной мРНК и подавляющий ее биологическую активность за счет образования с ней дуплекса, что препятствует трансляции мРНК на рибосомах. Природные А.РНК являются ключевыми компонентами одной из систем негативной регуляции экспрессии генов как у бактерий, так и у эукариот. Для искусственного получения А.РНК в экспрессионный вектор вставляют нуклеотидную последовательность ДНК из целевого гена в обратной ориентации по отношению к промотору, чтобы транскрибировалась незначащая цепь гена с образованием А.РНК; затем на такой рекомбинантной плазмиде осуществляют синтез А.РНК (обычно в бактериальных клетках). Искусственная А.РНК используется в экспериментальной работе, а также как средство для лечения различных патологий. Использовать А.РНК для подавления экспрессии генов впервые было предложено Дж. Изантом и Г. Вайнтраубом в 1984 г

3.2) Использование рибозимов (M1 субъединица РНКазы P, hammerhead-рибозимы).

Одними из основных различий, обнаруживаемых между нормальными и раковыми клетками, являются генетические различия ряда генов, контролирующих пролиферацию. В геноме опухолевых клеток часто  обнаруживают мутации в генах  двух типов: онкогенах и генах-супрессорах опухолевого роста, или антионкогенах.

Онкогены эволюционно консервативны  и вызывают неопластическую трансформацию  клеток как при ретровирусной инфекции в природных условиях (поскольку они часто бывают включены в состав генома ретровирусов), так и после введения ДНК онкогенов в культивируемые клетки с помощью трансфекции. Большинство онкогенов вначале было обнаружено именно в составе генома онкогенных вирусов, и они являются мутантными производными протоонкогенов, присутствующих в здоровых клетках многоклеточных организмов и активирующихся во время эмбриогенеза, роста клеток или регенерации тканей. Поскольку активированные онкогены в опухолевых клетках, как правило, сверхэкспрессируются и кодируемая ими РНК по своей первичной структуре отличается от РНК протоонкогенов, РНК онкогенов являются хорошей потенциальной мишенью для рибозимов. Мутация в кодоне 12 гена H-ras , приводящая к замене GGC на GUC, создает консенсусный сайт, по которому HH-рибозим может расщеплять мутантную мРНК. In vitro было продемонстрировано пятикратное различие в эффективности действия рибозима на мутантную H-ras-РНК и соответствующую РНК дикого типа. Получены H-ras-зависимые линии клеток, стабильно трансформированные экспрессирующим вектором, который направлял синтез HH-рибозима под контролем промотора бета-актинового гена. Для таких клеток характерна пониженная скорость пролиферации, сопряженная с уменьшением внутриклеточных уровней H-ras-РНК и белка р21 , кодируемого этим геном. Далее рибозим экспрессировали в клетках линии EJ карциномы мочевого пузыря человека . Введение исходных клеток мышам сопровождалось их быстрой гибелью на фоне развития высокоинвазивных опухолей. В отличие от этого клоны EJ-клеток, экспрессирующих рибозим, в организме мышей обладали резко сниженным опухолевым фенотипом. Образующиеся опухоли были малоинвазивны, и наблюдалось приблизительно двукратное повышение уровня выживаемости мышей с трансплантатами. Гистологические исследования подтверждали слабую способность опухолей к метастазированию. Рибозимы в опухолях обнаруживались методом ПЦР на протяжении 86-90 дней.  елковый продукт гена c-fos участвует в передаче сигнала эукариотическими клетками, вовлечен в синтез ДНК и может придавать клеткам устойчивость к противоопухолевым препаратам. Последние два свойства этого белка находят подтверждение в том, что при проведении лечения часто используемым противоопухолевым лекарством цисплатином (цис-диаминодихлорплатина) происходит индукция гена c-fos вслед за генами dTMP-синтазы и ДНК- полимеразы .

Рибозим, разрушающий c-fos-мРНК, снижал конечный уровень экспрессии гена c-fos, приводил к повышению чувствительности опухолевых клеток к химиотерапевтическим агентам (включая цис- платину) и значительно подавлял экспрессию генов dTMP-синтазы, ДНК-полимеразы бета и гена металлотионеина человека hMTII-A .

Аберрантная филадельфийская хромосома образуется в результате транслокации (9;22)(q34;q11) в стволовых клетках костного мозга, что сопровождается слиянием генов bcr и abl с образованием химерного онкогена bcr/abl и развитием хронических миелоидных лейкозов (ХМЛ) . Транскрипт химерного гена кодирует белок р210bcr/abl , который обладает повышенной активностью тирозинкиназы. Такие РНК и белок обнаруживаются почти у всех больных с синдромом ХМЛ, а также у 50% пациентов с острым лимфобластоидным лейкозом , у которых имеется филадельфийская хромосома.

С помощью рибозимов, специфически расщепляющих последовательность химерной мРНК в месте стыковки последовательностей двух генов, удалось подавить экспрессию химерного гена bcr/abl в культивируемых клетках.

Экспрессия рибозимов в культивируемых клетках вызывала снижение уровня bcr/abl-мРНК, полностью блокировала образование химерного белка р210bcr/abl и ингибировала рост клеток на 84%. Эти результаты были значительно лучше эффектов, вызываемых антисмысловыми олигонуклеотидами.

В других работах был получен  рибозим, расщепляющий химерную РНК по кодону GUU, расположенному по соседству с местом стыковки последовательностей двух генов. Этот рибозим разрушал соответствующую РНК in vitro и in vivo, а также подавлял тирозинкиназную активность белка р210.

3.3) Использование РНК интерференции.

РНК-интерференция  – подавление экспрессии генов с  помощью двухцепочечной РНК – была открыта в середине 90-х годов ХХ века при изучении круглого червя Caenorhabditis elegans. Во всех случаях основным действующим агентом РНК-интерференции служит так называемая малая интерферирующая РНК, которая представляет собой короткую молекулу двухцепочечной РНК длиной 19 пар нуклеотидов с выступающими с каждого 3\'-конца двумя неспаренными нуклеотидами. В цитоплазме siRNA связывается с белками-ферментами, при этом образуется комплекс RISC (RNA-induced silencing complex) . Один из ферментов RISC, хеликаза, расплетает двухцепочечную siRNA, после чего в составе комплекса остается одна (направляющая) цепь siRNA, которая узнает участок с комплементарной последовательностью (мишень РНК-интерференции) в молекуле мРНК и связывается с этим участком. Вторая (пассажирская) цепь siRNA разрушается. Связывание служит сигналом для другого фермента RISC, рибонуклеазы, делающей одиночный разрыв мРНК в области комплементарного взаимодействия. Образовавшиеся в результате фрагменты мРНК быстро расщепляются затем другими внутриклеточными рибонуклеазами. Таким образом, при РНК-интерференции подавление экспрессии индивидуальных генов происходит за счет деградации соответствующих мРНК и, следовательно, уменьшения синтеза соответствующих белков. 
Поскольку одним из основных свойств описанного процесса является высокая специфичность, вскоре после открытия РНК-интерференции стало понятно, что этот феномен может иметь огромное практическое значение. Действительно, за последние несколько лет появилось много работ, в которых описывается использование технологии РНК-интерференции для изучения функций генов (functional screening) , выбора мишеней для терапевтического воздействия, подтверждения правильности выбора этих мишеней (target identification and validation)  и, наконец, для генотерапии прежде всего вирусных и онкологических заболеваний.

Суть механизма РНК-интерференции  заключается в том, что при  введении в клетки короткой двунитевой РНК (днРНК) она способна вызывать специфическое разрушение той мРНК, с которой имеет гомологию. Сначала днРНК разрезается специальным ферментом на короткие фрагменты размером от 19 до 21 пар нуклеотидов. После небольших химических модификаций эти короткие днРНК образуют специфический комплекс с определенными клеточными белками. В этом комплексе днРНК расплетается и становится однонитевой. Затем короткая однонитевая РНК в силу своей комплементарности взаимодействует со строго определенной мРНК (копией гена-мишени), что является сигналом для "разрезания" последней ферментами комплекса. Образующиеся в результате этого короткие фрагменты мРНК уже не способны обеспечивать синтез полноценного белка. Таким образом, конструируя различные днРНК можно подавлять синтез строго определенных белков в клетке, не изменяя при этом структуру кодирующих их генов.

3.4) Использование интрател.

Интратела — семейство антител, обладающих специфичностью и высоким сродством связывания антиген в сочетании с их устойчивой способностью локализоваться в определенных местах внутри клетки. И. могут быть использованы в качестве терапевтического средства, мишенью которого является конечный продукт энзиматической реакции.

3.5) Использование доминантно-негативных  белков.

Мутации в антионкогене р53 обнаруживают в 50% солидных опухолей у человека. Продукт гена р53 выполняет функции активатора транскрипции других генов, ингибирующих переход нормальных клеток от фазы G1 к S-фазе клеточного цикла . Внутриклеточный уровень этого белка возрастает в ответ на повреждение геномной ДНК, что сопровождается задержкой клеток в фазе G1 и репарацией повреждений, а также терминальной дифференцировкой или же, если повреждения ДНК оказываются слишком большими, - апоптозом - генетически запрограммированным самоубийством клеток.

Инактивация белка р53 ассоциируется с неконтролируемым ростом опухолевых клеток многих типов. Было установлено, что введение функционально активного трансгена р53 в клетки с поврежденным геном белка р53 подавляет рост опухолевых клеток или индуцирует в них апоптоз.

3.6) Использование аптамеров.

Аптамеры являются высокоаффинными и очень специфичными лигандами. Аптамеры к белкам часто связываются в функционально-важных участках молекулы и являются ингибиторами активности белков-мишеней .По большинству своих характеристик аптамеры не уступают моноклональным антителам и могут быть использованы вместо антител во многих экспериментах. В то же время, аптамеры обладают значительно большей стабильностью, чем антитела.Обасти применения аптамеров.

1) Аптамеры используют для изучения механизмов взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами. В случае белков, узнающих специфические последовательности нуклеиновых кислот in vivo, использование SELEX позволяет выявить природные последовательности связывания белков с РНК или ДНК. Анализ трехмерной структуры аптамер-белковых комплексов используется для исследования структуры РНК- и ДНК-связывающих сайтов белков-мишеней.

2) На основе аптамеров могут быть получены высокоэффективные и специфичные ингибиторы белков-мишеней. Подобные ингибиторы могут использоваться как в фундаментальных исследованиях (в частности, в функциональных исследованиях белков-мишеней), так и для создания новых лекарственных средств. Мишенями в данном случае могут являться, например, различные факторы роста, гормоны, ферменты, рецепторы на клеточной поверхности, токсины, белки вирусов и патогенных микроорганизмов. Несколько лекарств на основе аптамеров в настоящее время проходят клинические испытания, а первый из препаратов уже поступил на фармацевтический рынок. Кроме непосредственного применения аптамеров в качестве специфических ингибиторов, их можно использовать для поиска новых ингибиторов различных белков. С этой целью проводится направленный поиск молекул, конкурирующих с аптамером-ингибитором за связывание с белком-мишенью и, таким образом, взаимодействующих в том же участке белка, что и исходный аптамер.

3) Аптамеры находят широкое применение для детекции различных молекул-мишеней (в том числе в диагностических целях). Было показано, что аптамеры могут с успехом заменить антитела в методиках ELISA, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), Вестерн-блоттинга и др. Аптамеры используют для измерения концентрации различных метаболитов и белковых факторов, для обнаружения токсинов, выявления специфических типов клеток и тканей, клеток болезнетворных микроорганизмов. Кроме того, аптамеры, как и антитела, можно использовать для аффинной очистки и идентификации белков-мишеней Наиболее перспективным с точки зрения диагностики является создание микрочипов, содержащих в своем составе большое количество аптамеров, которые могут быть использованы для одновременного анализа многих молекул-мишеней . Созданы чипы, позволяющие анализировать концентрацию некоторых факторов роста в крови человека. В дальнейшем предполагается создать микрочипы для анализа экспрессии большого числа различных белков человеческой клетки, что должно иметь огромное значение для развития методов диагностики различных заболеваний, а также в фундаментальных исследованиях.

3.7) Использование цинк-связывающих  белков, блокирующих транскрипцию.