Генотерапия раковых заболеваний

Интерферон (ИФН), также как и интерлейкин_2 (ИЛ_2), не является типичным противоопухолевым  препаратом. Тем не менее, его можно  отнести к классу средств, обладающих противоопухолевым действием, благодаря  целому ряду биологических свойств, включая влияние на процессы программированного клеточного роста, дифференцировку  и другие клеточные функции. По структуре  ИФН – это секреторные гликопротеины. На сегодняшний день известно 5 типов  ИФН (альфа, бэта, гамма и еще 2). У человека ИФН альфа, бета, гамма кодируются 3 различными генами и, следовательно, существует лишь один тип каждого из этих интерферонов. ИФН альфа кодируется 25 генами, что объясняет существование 25 различных

подтипов  ИФ альфа. На долю ИФН альфа приходится 90% всех альфа_ИФН. На практике

широко используются 2 разновидности рекомбинантного  ИФН – интерферон альфа (роферон А) и интерферон_альфа (интрон А, реаферон). Биологическая активность ИФН заключаются в их противовирусном, противомикробном, антипролиферативном и иммуномодулирующем действии. Антиканцерогенные свойства α_ИФН связаны со способностью стимулировать систему репарации ДНК, модулировать экспрессию генов, вовлеченных в процесс канцерогенеза, подавлять клеточную репликацию онковирусов, контролировать ангионеогенез, активировать эффекторные клетки (Т_лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки), а также увеличивать клеточную адгезию, продукцию других цитокинов. Более чем в 50% случаев солидные опухоли (меланома, колоректальный рак, рак шейки матки, рак молочной железы, мелкоклеточный рак легкого, хорионкарцинома) утрачивают один или большее число аллелей главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I. В то же время молекулы MHC I класса, представленные на поверхности опухолевых клеток, являются мишенями для макрофагов, которые запускают противоопухолевую иммунную реакцию. ИФН регулирует экспрессию МНС_антигенов I типа на поверхности опухолевых клеток и МНС_антигенов II типа на макрофагах, что делает опухолевую клетку уязвимой для различных эффекторов иммунной системы. Помимо антипролиферативного действия, ИФН влияет также на различные физиологические параметры клеток. Он вызывает изменения цитоскелета, включая повышение структурированности микрофиламентов, перераспределение фибронектина, увеличение объема клеток, которые становятся более уплощенными, повышение ригидности плазматической мембраны и снижение подвижности клеток. Эти эффекты играют существенную роль в противоопухолевой активности.

Интерлейкины объединяются следующими общими свойствами: 1) синтезируются клетками иммунной системы в процессе реализации механизмов естественного или специфического иммунитета; 2) проявляют свою активность при очень низких концентрациях (порядка 10_11 моль/л); 3) служат медиаторами иммунной и воспалительной реакций и обладают аутокринной, паракринной и эндокринной активностью; 4) действуют как факторы роста и дифференцировки клеток (при этом вызывают преимущественно медленные клеточные реакции, требующие синтеза новых белков); 5) образуют регуляторную сеть, в которой отдельные элементы обладают синергическим или антагонистическим действием; 6) обладают полифункциональной активностью.

 

2. Активная иммунотерапия.
1. прямая иммунизация немодифицированными раковыми клетками.

 

Цель онковакцины - стимулировать распознавание, атаку и уничтожение опухолевых клеток иммунной системой. В отличие от вакцин для профилактики инфекционных болезней, онковакцины направлены на лечение. Существует несколько типов онковакцин, среди которых есть основанные на нуклеиновых кислотах, на моноклональных антителах и на клетках. Среди клеточных вакцин выделяют основанные на дендритных и на опухолевых клетках. Также используются комбинации различных методов и генетическая модификация клеток.

 

Вакцины, основанные на опухолевых клетках:

 Цельные  опухолевые клетки, обезвреженные  радиоактивным излучением и смешанные  с усилителем иммунологического  действия (адъювантом), были одной  из самых ранних форм клеточной  терапии. Этот подход позволяет  обойти необходимость идентификации  опухолевых антигенов перед терапией  и позволяет получить в данной  вакцине сочетание всех значимых  антигенов. Начальные клинические  испытания показали безопасность  этого подхода - побочные эффекты  сводились преимущественно к  местным реакциям в области  инъекции. Иммуногенность таких   вакцин может быть улучшена  использованием опухолевых клеток  с привнесёнными генами, кодирующими  ключевые компоненты иммунного  ответа (цитокины, например, такие как  гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, и костимулирующие молекулы).

 

 Цельноклеточные вакцины прошли клинические испытания. Melacine® (Corixa Corporation) состоит из лизированных клеток двух клеточных линий меланомы человека и запатентованного адъюванта. Она одобрена к применению при метастатической меланоме в Канаде. На рынке США цельноклеточные вакцины пока отсутствуют.

 

Аутологичные клеточные вакцины

Аутологичные клеточные вакцины разрабатываются компанией AVAX Inc. После хирургического извлечения злокачественной опухоли пациента опухолевые клетки обрабатывают динитрофенилом (ДНФ), химическим веществом, известным как гаптен, связывающимся с поверхностью клетки и усиливающим иммунный ответ. Обработанные ДНФ клетки смешивают с адъювантом, позволяющим увеличить их иммуногенную эффективность, и вводят обратно пациенту. Иммунная система после этого способна лучше находить, распознавать и атаковать оставшиеся опухолевые клетки, которые, возможно, метастазировали в другие части организма. Эти оставшиеся опухолевые клетки, не будучи распознанными и уничтоженными, потенциально способны давать новые опухоли, зачастую ведущие к гибели пациента. Иммунные реакции помогают выявить, какие чужеродные белки атаковать. Способность ДНФ модифицировать белки и облегчать иммунной системе идентификацию их как чужеродных была доказана более 30 лет назад. Технология аутологичных клеточных вакцин использует эти механизмы как по отношению к белкам, так и к другим молекулам, воздействуя на иммунную систему пациента для предотвращения рецидива и улучшения выживаемости.

 

Вакцины, использующие одновременно различные опухолевые антигены.

Злокачественная опухоль сложна для высокоточной, прицельной терапии еще и из-за того, что из-за постоянных мутаций  её клеток она представляет собой  гетерогенную популяцию. Это означает, что какой-либо маркёр или антиген  может присутствовать в одних  и отсутствовать в других клетках  опухоли. Onyvax Ltd Cell Vaccines решает эту проблему одновременным введением множества опухолевых антигенов. Эти вакцины производят из нескольких иммортализованных клеточных линий, которые представляют различные стадии дифференцировки опухолей. За счет этого увеличивается эффективность вакцины и снижается вероятность развития побочных эффектов по сравнению с недифференцированной по стадиям терапией. Этот подход, в частности, эффективен в случаях, когда мало известно о клеточном составе потенциальной мишени определённого опухолевого типа, как при раке простаты. Onyvax ведёт клинические испытания продукта для лечения рака простаты и находится в начале завершающей стадии.

 

2. прямая иммунизация модифицированными раковыми клетками.

 

Более современный  подход - использование вакцин, содержащих генетически модифицированные клетки. Иммунная система пациента должна различать  здоровые и опухолевые клетки. При  этом опухолевые воспринимаются как  чужеродные или больные. Однако иногда опухолевые клетки способны индуцировать иммунологическую толерантность,  нарушая  распознавание клеток и адекватную работу врождённого и приобретённого иммунитета. Цель многих подходов клеточной  и генной терапии - позволить иммунной системе распознать и уничтожить опухолевые клетки так же, как она  делает это с клетками, пораженными  вирусной инфекцией. Для ликвидации толерантности к опухолевым клеткам  эти клетки необходимо модифицировать переносом генов. Затем эти генетически  модифицированные опухолевые клетки вводят пациенту. Наиболее распространённая генная модификация вакцин использует цитокины - они продуцируются в  высоких концентрациях по соседству  с опухолевыми клетками и, активируя  местные иммунологические реакции, усиливают работу антигенпрезентирующих клеток и, следовательно, опухолеспецифических Т-лимфоцитов. Это позволяет избежать побочных эффектов, связанных с системной терапией цитокинами. Примером такой вакцины служит описанная ниже GVAX вакцина.

 

Опухолевая  вакцина GVAX

Cell Genesys разрабатывает GVAX вакцины, состоящие из облучённых опухолевых клеток аутологичного происхождения или полученные из опухолевых клеточных линий (аллогенные). Эти опухолевые клетки генетически модифицировали, чтобы получить синтез ими иммуностимулирующего гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), способного стимулировать иммунный ответ в отношении как обнаружения, так и уничтожения опухолевых клеток, возможно, оставшихся после хирургического вмешательства и/или химио-радиотерапии. Закончены пять клинических испытаний (1-2 фазы) вакцин в терапии почечноклеточной карциномы, меланомы, рака простаты. Важным преимуществом противоопухолевых вакцин GVAX  является то, что они представляют собой цельноклеточные вакцины, для которых не требуется выделения специфических опухолевых антигенов. Какие именно противоопухолевые антигены наиболее эффективны терапевтически - неизвестно, поэтому подход Cell Genesys использует множество опухолевых антигенов и преодолевает необходимость прицельного выделения специфических наиболее эффективных при вакцинотерапии опухоли антигенов. Были получены доказательства того, что GVAX продемонстрировала противоопухолевую активность в отношении всех пяти типов опухолей, которые были включены в испытания (рак простаты, рак поджелудочной железы, рак лёгкого, меланома, опухоли почки). Это наводит на мысль, что GVAX может применяться при многих типах опухолей (Jaffee et al 2001). Применяются также пациент-специфичные вакцины GVAX, полученные из собственных опухолевых клеток пациента при использовании аденовирусной системы доставки генов, разработанной компанией. В условиях госпиталя процесс изготовления вакцины занимает около суток. В настоящее время Cell Genesis проводит 2 фазу клинических испытаний противоопухолевой вакцины GVAX при раке простаты, 1-2 фазы противомиеломной вакцины и в 2001 году инициировала дополнительные клинические испытания как по этим онконозологиям, так и по раку поджелудочной железы и лейкемии.

 

3. использование дендритных ктеток

 

Основы  дендритноклеточных вакцин

Дендритные  клетки (dendritic cells – DCs) названы так за длинные отростки и представляют собой систему лейкоцитов, широко представленную во всех тканях, особенно в тех, которые обеспечивают контакт с внешней средой. DCs происходят из костномозговых предшественников и до миграции в периферические ткани незрелые клетки циркулируют в кровяном русле. В тканях DCs дифференцируются и активизируются, принимая участие в процессинге тканевых антигенов, обеспечивая их презентацию на своей поверхности вместе с молекулами главного комплекса гистосовместимости (MHC). При соответствующей стимуляции происходит дальнейшее созревание DCs и они мигрируют во вторичные лимфоидные органы, где представляют антигены Т-клеткам и таким образом индуцируют иммунный ответ. Дендритные клетки могут быть получены из CD-34+ предшественников, в ответ на воздействие г-КСФ и фактор некроза опухоли (FNT) и из моноцитов, культивируемых в присутствии макрофагального КСФ и интерлейкина-4. DCs обладают способностью инициировать Т-клеточный ответ и рассматриваются как потенциально эффективная вакцина для иммунотерапии в онкологии.

 

Преклинические и клинические исследования DC вакцин

Дендритные  клетки являются наиболее мощными антигенпрезентирующими клетками и единственными, способными представлять новые антигены неактивированным Т-клеткам. Большое число DCs может быть получено in vitro в присутствии соответствующих цитокинов из адгезивной мононуклеарной фракции периферической крови или CD-34+ предшественников. Препараты, содержащие DCs для применения в онкологии:

 

DCs сепарированные по градиенту плотности и прошедшие селекцию по соответствующим маркёрам (CMRF-44+, CMRF-56+).

 

DCs полученные из адгезивной фракции мононуклеаров и сортированные по CD-14+

 

DCs, полученные из гемопоэтических стволовых клеток сортированных по CD-34+

 

Несколько преклинических исследований продемонстрировали эффективность нагруженных антигенами дендритных клеток в получении опосредованного противоопухолевого ответа. Клинические испытания показали, что DCs - перспективный инструмент для иммунотерапии опухолей. В этих исследованиях у пациента забирали клетки белой крови, культивировали вне организма в присутствии цитокинов на протяжении определённого периода времени (обычно 10-11 дней) и полученные DCs  перед обратной инфузией пациенту «нагружали» опухолевыми антигенами. Вакцина BLP25 (Biomira Inc), основанная на лицензионной технологии Cancer Vac Ltd, находится на стадии 2б фазы рандомизированного клинического исследования с участием пациентов, больных метастатической формой немелкоклеточного рака лёгкого. Цель исследования - получение доказательств безопасности препарата и свидетельства его положительного влияния на выживаемость пациентов. В основе этой вакцины лежит мощный первичный Т-клеточный ответ (направленный на анти-MUC1), получаемый в результате сокультивирования DCs человека с липосомами BLP25 и последующего введения в культуру аутологичных Т-лимфоцитов.

 

Центр клеточной  и генной терапии, расположенный  в медицинском колледже Бейлора (Хьюстон, Техас) проводит 3 фазу испытаний экспериментального препарата, стимулятора созревания дендритных клеток, состоящего из множества цитокинов. Обработанные препаратом DCs применяют у пациентов с рецидивирующей формой лимфомы Ходжкина.

28 компаний  развивают направление противоопухолевых  вакцин, основанных на клетках.  Из них 12 используют дендритные  клетки (см. таблицу).

 

Манипуляции с дендритными клетками in vivo

Исследователи клиники Мейо на модели низкоиммуногенной меланомы B16 показали, что терапевтическое воздействие введения B7-DCs перекрёстных антител приводит к повышению секреции IL-12 и иммунотерапевтическому эффекту (Radhakrishnan et al 2004). Манипуляции с дендритными клетками in vivo предпочтительнее для практического использования в клинике, чем иммунотерапия на основе дендритных клеток, использующая методики in vitro. Указанные перекрёстные антитела не являются пациент-специфичными и могут использоваться у всех больных.

 

Слияние дендритных и опухолевых клеток

Слияние опухолевых и дендритных клеток используется при  приготовлении пациент-специфичных противоопухолевых вакцин. Технология предусматривает объединение дендритных клеток пациента и его инактивированных опухолевых клеток, при использовании химического или электрослияния. Полученные клетки вводятся обратно пациенту. Технология слияния клеток опять же обходит необходимость идентификации соответствующих специфических опухолевых антигенов, так как они представлены в совокупности всех антигенов, полученных из опухоли. Однажды введённая, опухолевая вакцина стимулирует распознавание и уничтожение иммунной системой опухолевых клеток, имеющих антигены, представленные в вакцине. Антигены, фрагменты протеинов, представленных в опухолевых клетках, выполняют роль маркеров, направляющих иммунную реакцию на эти клетки. Благодаря тому, что вакцины вызывают системный иммунный ответ, они потенциально способны уничтожать опухолевые клетки во всём организме.

 

Как было показано на различных крысиных моделях, иммунизация  гибридами дендритных и опухолевых клеток приводила к возникновению  защитного иммунитета и препятствовала развитию опухолей. Имеются как данные работ in vitro, так и опубликованные результаты 1-2 фаз клинических испытаний среди пациентов с прогрессирующей метастатической почечноклеточной карциномой, в которых использовались предшественники дендритных клеток от здоровых людей, слитые с аллогенными либо аутологичными клетками опухоли пациента (Marten et al 2003). В последних было показано увеличение реактивности против возвращаемых антигенов, что наблюдалось у большинства пациентов в виде возросшей цитотоксичности лимфоцитов периферической крови к клеткам почечноклеточной карциномы и увеличения числа интерферон-продуцирующих клеток.