Кинетика и термодинамика ферментативных реакций

Повышение температуры тела (лихорадочное состояние) ускоряет биохимические  реакции, катализируемые ферментами. Нетрудно подсчитать, что увеличение температуры  тела на каждый градус повышает скорость реакции примерно на 20%. При высоких  температурах около 39-40°С расточительное использование эндогенных субстратов в клетках больного организма обязательно требуется восполнять их поступление с пищей. Кроме того, при температуре порядка 40°С часть весьма термолабильных ферментов может денатурироваться, что нарушает естественный ход биохимических процессов. 

Низкая температура вызывает обратимую инактивацию ферментов вследствие незначительного изменения его пространственной структуры, но достаточного для нарушения соответствующей конфигурации активного центра и молекул субстрата.

2.2 Зависимость скорости реакции от рН среды

Для большинства ферментов  имеется определенное значение рН, при котором их активность максимальна; выше и ниже этого значения рН активность этих ферментов уменьшается. Однако не во всех случаях кривые, описывающие  зависимость активности фермента от рН, имеют колоколообразную форму; иногда эта зависимость может выражаться также прямой. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН главным  образом свидетельствует о состоянии  функциональных групп активного  центра фермента. Изменение рН среды  влияет на ионизацию кислых и основных групп аминокислотных остатков активного  центра, которые участвуют или  в связывании субстрата (в контактном участке), или в его превращении (в каталитическом участке). Поэтому  специфическое влияние рН может  быть вызвано или изменением сродства субстрата к ферменту, или изменением каталитической активности фермента, или обеими причинами вместе.

Большинство субстратов имеют  кислотные или основные группы, поэтому  рН влияет на степень ионизации субстрата. Фермент предпочтительно связывается  или с ионизированной, или с  неионизированной формой субстрата. Очевидно, при оптимальном рН и функциональные группы активного центра находятся в наиболее реакционноспособном состоянии, и субстрат находится в форме, предпочтительной для связывания этими группами фермента. 

При построении кривых, описывающих  зависимость активности фермента от рН, измерения при всех значениях  рН обычно проводят в условиях насыщения  фермента субстратом, поскольку величина K_m для многих ферментов изменяется с изменением рН.

Кривая, характеризующая  зависимость активности фермента от рН, может иметь особенно простую  форму в тех случаях, когда  фермент действует на электростатически нейтральные субстраты или субстраты, у которых заряженные группы не играют существенной роли в каталитическом акте. Примером таких ферментов служит папаин, а также инвертаза, катализирующая гидролиз нейтральных молекул сахарозы и сохраняющая постоянную активность в интервале рН 3,0-7,5.

Значение рН, соответствующее  максимальной активности фермента, не обязательно совпадает со значением  рН, характерным для нормального  внутриклеточного окружения этого  фермента; последнее может быть как  выше, так и ниже оптимума рН. Это  позволяет предположить, что влияние  рН на активность фермента может быть одним из факторов, ответственных  за регулирование ферментативной активности внутри клетки. Поскольку в клетке содержатся сотни ферментов, и каждый из них по-разному реагирует на изменение рН, значение рН внутри клетки является, возможно, одним из важных элементов в сложной системе  регуляции клеточного метаболизма. 

 

2.3 Влияние концентрации субстрата и фермента на скорость ферментативной реакции

Рассмотрим влияние концентрации субстрата на скорость ферментативной реакции (рис. 30.). При низких концентрациях  субстрата скорость прямо пропорциональна  его концентрации, далее с ростом концентрации скорость реакции увеличивается  медленнее, а при очень высоких  концентрациях субстрата скорость практически не зависит от его  концентрации и достигает своего максимального значения (Vmax). При таких концентрациях субстрата все молекулы фермента находятся в составе фермент-субстратного комплекса, и достигается полное насыщение активных центров фермента, именно поэтому скорость реакции в этом случае практически не зависит от концентрации субстрата.

Рис. Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата 

График зависимости активности фермента от концентрации субстрата  описывается уравнением Михаэлиса – Ментен, которое получило свое название в честь выдающихся ученых Л.Михаэлиса и М.Ментен, внесших большой вклад в исследование кинетики ферментативных реакций,

где v – скорость ферментативной реакции; [S] – концентрация субстрата; KM – константа Михаэлиса.

Рассмотрим физический смысл  константы Михаэлиса. При условии, что v = ½ Vmax, получаем KM = [S]. Таким образом, константа Михаэлиса равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной.

Скорость ферментативной реакции зависит и от концентрации фермента (рис. 31). Эта зависимость  носит прямолинейный характер.

Зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента

 

2.4  Определение количества фермента по его активности

Содержание фермента в  данном растворе или в тканевом экстракте  можно определить, измеряя его  каталитический эффект. Для этого  необходимо знать:

1) общую стехиометрию  катализируемой реакции;

2) возможную потребность  в кофакторах - в ионах металлов или коферментах;

3) зависимость активности  фермента от концентраций субстрата  и кофактора, т.е. величины K_m как для субстрата, так и для кофактора;

4) значение рН, соответствующее  максимальной активности фермента;

5) область температур, при  которых фермент устойчив и  сохраняет высокую активность.

Кроме того, необходимо иметь  в своем распоряжении какую-нибудь достаточно простую аналитическую  методику, позволяющую определять скорость исчезновения субстрата или скорость появления продуктов реакции.

Всегда, когда это возможно, анализ на содержание фермента проводится в стандартных условиях, при которых  поддерживается оптимальное значение рН и концентрация субстрата, превышающая  концентрацию насыщения; в этом случае начальная скорость соответствует  нулевому порядку реакции в отношении  субстрата и пропорциональна  только концентрации фермента. Для ферментов, нуждающихся в кофакторах - ионах металлов или коферментах, концентрация этих кофакторов также должна превышать концентрацию насыщения, с тем, чтобы фактором, лимитирующим скорость реакции, была концентрация фермента. Обычно измерение скорости образования продукта реакции может быть проведено с большей точностью, чем измерение скорости исчезновения субстрата, так как для поддержания кинетики нулевого порядка субстрат, как правило, должен присутствовать в сравнительно высоких концентрациях. Скорость образования продукта (или продуктов) реакции можно измерять химическими или спектр о фотометрическими методами. Второй способ более удобен, поскольку он позволяет непрерывно регистрировать ход реакции на лепте самописца.

По международному соглашению за единицу ферментативной активности принимается количество фермента, способное  вызвать превращение одного микромоля субстрата в минуту при 25°С в оптимальных условиях. Удельной активностью фермента называют число единиц ферментативной активности в расчете на 1 мг белка. Эту величину используют в качестве критерия чистоты ферментного препарата; она возрастает по мере очистки фермента и для идеально чистого препарата достигает максимального значения. Под числом оборотов понимают число молекул субстрата, подвергающихся превращению в единицу времени в расчете на одну молекулу фермента (или на один активный центр) в условиях, когда скорость реакции лимитируется концентрацией фермента.

 

 

 

 

 

 

 

Заключение

В данной работе был рассмотрен раздел энзимологии, изучающий зависимость  скорости химических реакций, катализируемых ферментами, от ряда факторов окружающей среды. Основоположниками данной науки  по праву считаются Михаэлис и Ментен, к оторые опубликовали свою теорию общего механизма ферментативных реакций, вывели уравнение, ставшее фундаментальным принципом всех кинетических исследований ферментов, оно служит отправной точкой при любом количественном описании действия ферментов. Исходное уравнение Михаэлиса - Ментен является уравнением гиперболы; свой вклад в кинетику внесли Лайнуивер и Бэрк, которые преобразовали уравнение Михаэлиса - Ментен и получили график прямой, по которой можно наиболее точно определить значение V_max.

С течением времени изменение скорости ферментативной реакции в ферментативной реакции в экспериментальных  условиях уменьшается. Снижение скорости может происходить за счёт ряда факторов: уменьшение концентрации субстрата, увеличение концентрации продукта, который может  оказывать ингибирующее действие, могут  происходить изменения рН раствора, изменения температуры среды. Так  при повышении температуры на каждые 10°С скорость реакции увеличивается в 2 раза и даже меньше. Низкая температура обратимо инактивирует ферменты. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН свидетельствует о состоянии функциональных групп активного центра фермента. Каждый фермент по-разному реагирует на изменение рН. Химические реакции можно останавливать путём действия на них различными видами ингибирования. Начальную скорость реакции можно быстро и точно определить при помощи таких приспособлений, как номограммные линейки, устройство к спектрофотометру и рН-метру. Это позволяет наиболее точно представить активность изучаемых ферментов.

Всё это активно используется в  наши дни в медицинской практике.

 

Список использованных источников

1. Белясова Н.А. Биохимия и молекулярная биология. - Мн.: книжный дом, 2004. - 416 с., ил.

2. Келети Т. Основы ферментативной кинетики: Пер. с англ. - М.: Мир, 1990. -350 с., ил.

3. Кнорре Д.Г. Биологическая химия: Учеб. для хим., биол. и мед. спец. вузов. - 3-е изд., испр. - М.: Высш. шк. 2002. - 479 с.: ил.

4. Крупяненко В.И. Векторный метод представления ферментативных реакций. - М.: Наука, 1990. - 144 с.

5. Ленинджер А. Биохимия. Молекулярные основы структуры и функции клетки: Пер. с англ. - М.: Мир, 1974.

6. Строев Е.А. Биологическая химия: Учебник для фармац. ин-тов и фармац. фак. мед. ин-тов. - М.: Высшая школа, 1986. - 479 с., ил.

7. Северин Е.С. Биохимия. а. - 5-е изд. - М.: ГЭОТАР - Медиа, 2009. - 786 с., ил.