Кинетика и термодинамика ферментативных реакций

1.3 Влияние концентрации субстрата на кинетику реакции

Во многих случаях условие  постоянства концентрации субстрата  не выполняется. С одной стороны, избыток субстрата не используется в реакции in vitro с некоторыми ферментами из-за часто происходящего ингибирования ферментативной активности субстрата. В этом случае можно применять только оптимальную его концентрацию, и это не всегда обеспечивает избыток субстрата, необходимый для выполнения кинетических уравнений обсуждаемых выше механизмов. Более того, в клетке in vivo избыток субстрата, необходимый для осуществления этого условия, обычно не достигается.

В ферментативных реакциях, где субстрат не находится в избытке  и, следовательно, его концентрация меняется в ходе реакции, константа  диссоциации фермент-субстратного комплекса равна

K_S = ([S] ₀ - [ES] - [P]) [E]_T - [ES])/[ES]

([S]₀ - концентрация субстрата при t = 0). В этом случае начальная скорость реакции (в стационарном состоянии) определяется формулой

v= V_max [S_t] / (K_m + [S_t])

где [S_t] - концентрация субстрата в момент времени.

Тем не менее, можно написать приблизительное решение для  двух случаев, когда [S]_о = [S_t]:

1) если это неравенство  выполняется из-за больших значений t, т.е. когда более 5% от начальной  концентрации субстрата израсходовалось  за время реакции;

2) если концентрацией  фермента нельзя пренебречь по  сравнению с концентрацией субстрата  и, таким образом, нужно принимать  во внимание концентрацию фермент-субстратного  комплекса.

Если t велико, а концентрация [ES] пренебрежимо мала по сравнению  с [S]₀, то уравнение константы диссоциации фермент-субстратного комплекса переходит в следующее:

K_S = ([S]₀ - [P]) ([E]_T - [ES]) / [ES]

Для значения концентрации [S_t], которая меняется в ходе реакции, удовлетворительным приближением служит значение ([S]₀ + [S_t])/2. Так как [S_t] = [S]₀ - [Р], среднюю скорость; можно выразить как

Подставив это выражение  и приблизительное значение [S_t] в

v= V_max [S_t] / (K_m + [S_t]),

получим:

При сравнении значений, рассчитанных на основе этого приближения, со значениями, полученными из точного, проинтегрированного уравнения  Михаэлиса - Ментен, оказывается, что ошибка в определении K_m составляет 1 и 4% при расходовании 30 и 50% субстрата соответственно. Следовательно, ошибка при данном приближении незначительна по сравнению с ошибкой измерения.

Когда расход субстрата не превышает 5% начальной концентрации, но концентрация фермента так велика, что [ES] по сравнению с [S]₀ нельзя не учитывать, константа диссоциации фермент-субстратного комплекса равна:

K_s = ([S]₀ - [ES]) ([E]_T - [ES]) / [ES]

Его решение относительно [ES] дает

Из двух возможных решений  может быть выбрано только отрицательное, так как только оно удовлетворяет  начальным условиям: [ES] = 0 при [S]₀ = 0 или [Е]_T = 0. По аналогии с уравнением отношения v/V_max мы получили уравнение начальной скорости. Квадратное уравнение, полученное из уравнения константы диссоциации фермент-субстратного комплекса, найденную чуть выше, с помощью формул v = k₂ [ES] и V_max = k₂ [E]_T, можно привести к следующему виду:

[S]₀ V_max / v = K_s V_max / (V_max - v) + [E]_T

Если известно V_max можно рассчитать K_s.

Следует учесть два предельных случая. В первом случае [S]<<K_m.

v = (V_max / K_m) [S] = k[S]

Таким образом, мы получили кажущуюся реакцию первого порядка  и k=V_max/K_m - кажущуюся кинетическую константу первого порядка. Ее фактическая размерность - время ^-1, но она является комбинацией констант скорости первого и второго порядков нескольких элементарных стадий, т.е. k₁k₂[E]_T/(k_-1 + k₂). При условиях кажущегося первого порядка k является мерой прохождения реакции.

Другой предельный случай: [S] >> K_m. Здесь константа K_m ничтожно мала по сравнению с [S], и, таким образом, получаем v = V_max. 

1.4 Образование кинетически устойчивого комплекса фермент - продукт

Если в ходе реакции  происходит образование кинетически  устойчивого комплекса фермент - продукт, механизм реакции выглядит следующим образом:

Применив предположение  о стационарном состоянии, можно  написать дифференциальные уравнения:

d [ES] /dt = k₁ [E] [S] + k_-2 [EP] - (k_-1 + k₂) [ES] = 0

d [EP] /dt = k₂ [ES] - (k_-2 + k₃) [EP] = 0

Из этих уравнений следует, что

[ES] = [(k_-2 + k₃) / k₂] [EP]

[E] = [(k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁k₂ [S]] [EP]

Так как v = k₃ [EP]

и [E]_T = [E] + [ES] + [EP] =

= [(k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁k₂ [S] + (k_-2 + k₃) / k₂ + 1] [EP] =

= {[k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃ + k₁ [S] (k_-2 + k₃) + k₁k₂ [S]] / k₁k₂ [S]} [EP]

получаем

[EP] = k₁k₂[S] [E]_T / [k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃ + k₁ [S] (k_-2 + k₃ + k₂)]

v = k₁k₂k₃[S] [E]_T / [k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃ + k₁ [S] (k_-2 + k₃ + k₂)] =

= [k₂k₃ / (k_-2 + k₃ + k₂)] [E]_T[S] / [(k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁ (k_-2 + k₃ + k₂) + [S]]

То есть

V_max = [k₂k₃ / (k_-2 + k₃ + k₂)] [E]_T

K_m = (k_-1 k_-2 + k_-1 k_-3 + k₂k₃) / k₁ (k_-2 + k₃ + k₂)

В этом случае уже очень  сложно вычислить конкретные значения индивидуальных констант скорости, так  как прямо измерить можно только их отношение. Ситуация еще более  затрудняется при усложнении механизма  ферментативной реакции, когда в  реакции участвуют больше двух комплексов, потому что количество констант скорости в уравнении, естественно, гораздо больше, и их соотношения также сложнее. 

Однако ситуация упрощается, если после обратимой реакции  образования первого комплекса  последующие элементарные стадии необратимы. Важными представителями ферментов, подчиняющихся этому механизму, являются протеолитические ферменты и  эстеразы. Механизм их реакции можно записать следующим образом:

где ES` - ацилферментное промежуточное соединение, которое разлагается под действием воды. Мы можем написать

d [P₂] /dt = d [P₁] / dt = v = k₁k₂k₃ [S] [E]₀ / [k₃(k_-1 + k₂) + [S] (k₂ + k₃)]

V_max = k₂k₃ [E]₀ / (k₂ + k₃) = k_кат [E]₀

K_m = k₃ (k_-1 + k₂) / (k₂ + k₃) k₁

k_кат / K_m = k₂k₁ / (k_-1 + k₂) = k₂ / K_m'

          Константа Михаэлиса стадии ацилирования - K_m' K_s. Чем больше отношение k_кат/K_m, тем выше специфичность субстрата. 

Определение констант значительно  упрощается, если эксперимент проводят в присутствии нуклеофильного агента (N), способного конкурировать с водой. Тогда

k₃ = k₃' [H₂O] и P_i (i = 1, 2, 3) - продукты.

v_i = k_{кат, i} [E₀] [S] / (K_m + [S])

k_{кат, 1} = k₂ (k₃ + k₄ [N]) / (k₂ + k₃ + k₄ [N])

k_{кат, 2} = k₂k₃ / (k₂ + k₃ + k₄ [N])

k_{кат, 3} = k₂k₄ [N] / (k₂ + k₃ + k₄ [N])

K_m = K_s (k₃ + k₄ [N]) / (k₂ + k₃ + k₄ [N])

1/v_N = K_s (k₃ + k₄ [N]) / k₂k₃ [S] [E₀] + (k₂ + k₃ + k₄ [N]) / k₂k₃ [E₀]

Так как известно, что  K_s/k₂ = K_m/ k_кат, и если нуклеофил отсутствует, то

1/v = K_s / k₂ [S] [E₀] + (k₂ + k₃) / k₂k₃ [E₀]

и для определения констант можно использовать точку пересечения  прямых в координатах 1/v_N (и 1/v) - 1/[S]. Две прямые линии в двойных обратных координатах пересекаются во втором квадранте. В отсутствии нуклеофила точка пересечения прямой с вертикальной осью определяется как 1/V_max и 1/k_кат[E₀], а с горизонтальной осью - как -1/K_m. Координаты точки пересечения двух прямых: -1/K_s и 1/k₃[E₀]. Расстояние между 1/V_max и 1/k₃[E₀] равно 1/k₂[E₀].

1.5 Анализ полной кинетической кривой реакции

Уравнение Михаэлиса - Ментен в исходном виде относится только к необратимым реакциям, т.е. к реакциям, где рассматривается только начальная скорость, а обратная реакция не проявляется из-за недостаточного количества продукта и не влияет на скорость реакции. В случае необратимой реакции полную кинетическую кривую можно легко анализировать (для произвольного интервала времени t), интегрируя исходное уравнение Михаэлиса - Ментен. В этом случае, следовательно, сохраняется предположение, что в ходе реакции образуется только один промежуточный фермент-субстратный комплекс. Так как для интервала времени t не ставится никаких ограничений, концентрация субстрата в момент анализа не может быть равной первоначально введенной его концентрации. Таким образом, также необходимо принимать во внимание изменение [S] в ходе реакции. Пусть S₀ - начальная концентрация субстрата, (S₀ - y) - концентрация в момент времени t. Тогда, на основе исходного уравнения Михаэлиса - Ментен (если y - количество превращенного субстрата), мы можем написать

dy / dt = V_max (S₀ - y) / (K_m +S₀ - y)

Взяв обратные величины и  разделив переменные, интегрируем по y в пределах от 0 до y (V_max обозначена как V):

(2,303 / t) lg [S₀ / (S₀ - y)] = V / K_m - (1 / K_m) (y / t)

Таким образом, построив график зависимости левой части уравнения  от y/t (координаты Фостера-Ниманна), получим прямую линию с наклоном (-1/K_m), отсекающую на оси ординат отрезок (V/K_m), а на оси абсцисс - отрезок V. Интегральное уравнение можно также линеаризовать по-другому:

t / 2,3031 lg [S₀ / (S₀ - y)] = y / 2,303 V lg [S₀ / (S₀ - y)] + K_m / V

или t/y = 2,3031 K_m lg [S₀ / (S₀ - y)] / V_y +1/V 

Если мы изучаем обратимую  реакцию, необходимо обращать внимание на то, с каким временным интервалом мы имеем дело. В момент смешения фермента с субстратом начинается так  называемая предстационарная фаза продолжительностью несколько микро- или миллисекунд, в течение которой образуются фермент-субстратные комплексы, соответствующие стационарному состоянию. При изучении обратимых реакций на достаточно протяженных отрезках времени эта фаза не играет значительной роли, так как в этой фазе реакция не протекает с полной скоростью ни в одном из направлений.

Для реакции, идущей слева  направо, фермент-субстратные комплексы, принимающие участие в реакции, достигают скоростьлимитирующей концентрации только в конце предстационарной фазы. Квазистационарное состояние, в котором концентрации скоростьопределяющих фермент-субстратных комплексов приближаются к максимальным значениям концентраций в стационарном состоянии, длится несколько десятых долей секунды или секунды. Во время этой фазы скорость образования продукта (или расходования субстрата) практически линейная во времени. Теоретически здесь образования продукта еще не произошло, а практически его концентрация настолько мала, что скорость обратной реакции не влияет на скорость прямой. Эта линейная фаза называется начальной скоростью реакции, до сих пор мы только ее и принимали во внимание. 

Реакция справа налево в  следующей фазе также ускоряется из-за постепенного увеличения концентрации продукта(переходное состояние; наблюдаемая до сих пор линейность во времени исчезает). Эта фаза продолжается до тех пор, пока скорость реакции слева направо не становится равной скорости реакции справа налево. Это - состояниединамического равновесия, так как реакция непрерывно продолжается в обоих направлениях с одинаковой скоростью.

 

2. Факторы, от которых зависит скорость ферментативной реакции

2.1 Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры

С повышением температуры  среды скорость ферментативной реакции  увеличивается, достигая максимума  при какой-то оптимальной температуре, а затем падает до нуля. Для химических реакций существует правило, что  при повышении температуры на 10°С скорость реакции увеличивается в два-три раза. Для ферментативных реакций этот температурный коэффициент ниже: на каждые 10°С скорость реакции увеличивается в 2 раза и даже меньше. Наступающее вслед за этим снижение скорости реакции до нуля свидетельствует о денатурации ферментного блока. Оптимальные значения температуры для большинства ферментов находятся в пределах 20 - 40⁰С. Термолабильность ферментов связана с их белковым строением. Некоторые ферменты денатурируют уже при температуре около 40⁰С, но основная часть их инактивируется при температурах выше 40 - 50⁰С. Отдельные ферменты инактивирует холод, т.е. при температурах, близких к 0°С, наступает денатурация.