Кинетика и термодинамика ферментативных реакций

Введение

Основу жизнедеятельности  любого организма составляют химические процессы. Практически все реакции  в живом организме протекают  с участием природных биокатализаторов - ферментов. Берцелиус в 1835 г. впервые предположил, что реакции живого организма осуществляются благодаря новой силе, которую он назвал «каталитической». Эту идею он обосновал главным образом экспериментальным наблюдением: диастаза из картофеля гидролизует крахмал быстрее, чем серная кислота. Уже в 1878 г. Куне назвал вещество, обладающее каталитической силой в живом организме, ферментом.

Кинетика действия ферментов - это раздел ферментологии, изучающий  зависимость скорости реакции, катализируемой ферментами, от химической природы  и условий взаимодействия субстрата  с ферментом, а также от факторов среды. Иначе говоря, кинетика ферментов  позволяет понять природу молекулярных механизмов действия факторов, влияющих на скорость ферментативного катализа. Этот раздел образовался на стыке  таких наук, как биохимия, физика и математика. Самая ранняя попытка  математически описать ферментативные реакции была предпринята Дюкло в 1898 г. Hа самом деле этот раздел по изучению ферментов очень важен в наше время, а именно для практической медицины. Он даёт фармакологам инструмент направленного изменения метаболизма клетки, огромное количество фармацевтических препаратов и различные яды - это ингибиторы ферментов.

Целью данной работы является рассмотрение вопроса о зависимости  скорости реакции от различных факторов, каким образом можно контролировать скорость реакций и как её можно  определить.

 

 

 

 

1. Кинетика ферментативных реакции. Уравнение Михаэлиса - Ментен

Предварительные эксперименты по изучению кинетики ферментативных реакций показали, что скорость реакции, вопреки теоретическим ожиданиям, не зависит от концентрации фермента (Е) и субстрата (S) таким образом, как в случае обычной реакции второго порядка.

Браун и независимо от него Анри впервые выдвинули гипотезу об образовании в ходе реакции  фермент-субстратного комплекса. Затем  это предположение подтвердили  три экспериментальных факта:

а) папаин образовывал нерастворимое  соединение с фибрином (Вюртц, 1880);

б) субстрат инвертазы сахароза могла защищать фермент от тепловой денатурации (О'Салливан и Томпсон, 1890);

в) было показано, что ферменты являются стереохимически специфическими катализаторами (Фишер, 1898-1899).

В 1913 г. Михаэлис и Ментен опубликовали свою теорию общего механизма ферментативных реакций: они ввели понятие максимальной скорости и показали, что кривая насыщения (т.е. зависимость скорости реакции от концентрации субстрата) является равнобочной гиперболой. Они доказали, что максимально наблюдаемая скорость есть одна из асимптот к кривой, а отрезок, отсекаемый на оси абсцисс (в области ее отрицательных значений) второй асимптотой, т.е. константа в уравнении скорости, равен по абсолютному значению концентрации субстрата, необходимой для достижения половины максимальной скорости. Михаэлис и Ментен предположили, что скорость реакции определяется распадом комплекса ES, т.е. константой k₂.Это возможно только при условии, что k₂ - наименьшая из констант скорости. В этом случае равновесие между фермент-субстратным комплексом, свободным ферментом и субстратом устанавливается быстро по сравнению со скоростью реакции (быстро устанавливающееся равновесие).

Начальную скорость реакции  можно выразить следующей формулой:

v = k₂ [ES]

Поскольку константа диссоциации  фермент-субстратного комплекса равна

K_S = [E] [S] / [ES] = k _-1/k₁ то концентрацию свободного фермента можно выразить как [E] =K_S [ES] / [S]

Общая концентрация фермента в реакционной смеси определяется формулой

[Е]_т = [Е] + [ЕS] = K_S [ЕS] / [S] + [ЕS]

Реакция достигает максимальной скорости, когда концентрация субстрата  достаточно высока, чтобы все молекулы фермента находились в виде комплекса  ЕS (бесконечно большой избыток субстрата). Отношение начальной скорости к теоретически возможной максимальной скорости равно отношению [ЕS] к [Е]_т:

v / V_max= [ES] / [E]_т= [ES] / (K_S [ES] / [S] + [ES]) = 1 / (K_S+[S] +1)

Это классическое уравнение Михаэлиса и Ментен, которое со времени его публикации в 1913 г. стало фундаментальным принципом всех кинетических исследований ферментов в течение десятилетий и с некоторыми ограничениями осталось таким до сих пор. 

Позднее было показано, что  оригинальное уравнение Михаэлиса - Ментен предполагало наличие нескольких ограничений. Оно справедливо, т.е. правильно описывает кинетику реакции, катализируемой данным ферментом, только при условии выполнения всех следующих ограничительных условий:

1) образуется кинетически  устойчивый фермент-субстратный  комплекс;

2) константа K_S является константой диссоциации фермент-субстратного комплекса: это справедливо, только если ;

3) концентрация субстрата  не меняется в ходе реакции,  т.е. концентрация свободного  субстрата равна его начальной  концентрации;

4) продукт реакции быстро  отщепляется от фермента, т.е.  не образуется кинетически значимого  количества ЕS комплекса;

5) вторая стадия реакции  необратима; точнее говоря, мы принимаем  во внимание только начальную  скорость, когда обратной реакцией (из-за фактического отсутствия  продукта) еще можно пренебречь;

6) с каждым активным  центром фермента связывается  только одна молекула субстрата;

7) для всех реагирующих  веществ вместо активностей можно  использовать их концентрации. 

Уравнение Михаэлиса - Ментен служит отправной точкой при любом количественном описании действия ферментов. Следует подчеркнуть, что кинетическое поведение большинства ферментов значительно сложнее, чем это вытекает из идеализированной схемы, лежащей в основе уравнения Михаэлиса - Ментен. При выводе этого уравнения предполагается, что существует только один фермент-субстратный комплекс. Между тем в действительности в большинстве ферментативных реакций образуется, по меньшей мере, два или три таких комплекса, возникающих в определенной последовательности.

Здесь через EZ обозначен  комплекс, соответствующий истинному  переходному состоянию, а через  ЕР - комплекс между ферментом и  продуктом реакции. Можно указать  также, что в большинстве ферментативных реакций участвует более одного субстрата и образуется соответственно два или большее число продуктов. В реакции с двумя субстратами, S₁ и S₂, может образоваться три фермент-субстратных комплекса, а именно ES₁, ES₂ и ES₁S₂. Если в результате реакции получается два продукта, P₁ и P₂, то может существовать, по меньшей мере, еще три дополнительных комплекса EP₁, EP₂ и EP₁P₂. В таких реакциях имеется много промежуточных стадий, каждая из которых характеризуется своей константой скорости. Кинетический анализ ферментативных реакций, в которых принимают участие два реагирующих вещества или более, часто оказывается исключительно сложным и требует использования электронных вычислительных машин. Тем не менее, при анализе кинетики всех ферментативных реакций отправной точкой всегда является рассмотренное выше уравнение Михаэлиса - Ментен. 

 

1.1 Природа константы K в уравнении

Второй постулат формулирует, что константа K_S в уравнении является константой диссоциации фермент-субстратного комплекса.

Бриггс и Холдейн в 1925 г. доказали, что исходное уравнение Михаэлиса - Ментен справедливо только при , т.е. когда равновесие элементарной стадии E+S ES устанавливается очень быстро по сравнению со скоростью следующей стадии. Поэтому такие кинетические механизмы (подчиняющиеся начальному условию Михаэлиса - Ментен и имеющие одну медленную элементарную стадию, относительно которой равновесия во всех других элементарных стадиях устанавливаются быстро) называются удовлетворяющими предположению о «быстром равновесии». Если, однако, k₂ по порядку величины сравнима с k_-1, изменение концентрации фермент-субстратного комплекса во времени можно выразить следующим дифференциальным уравнением:

d [ES] / dt = k₁ [E] [S] - k_-1 [ES] - k₂ [ES]

Так как мы рассматриваем  начальную скорость реакции, т.е. момент, когда обратная реакция еще не происходит, а предстационарная стадия уже прошла, то вследствие избытка субстрата количество образовавшегося фермент-субстратного комплекса равно количеству распавшегося (принцип стационарности, или кинетика Бриггса и Холдейна, или принцип Боденштейна в химической кинетике) и справедливо, что

d [ES] / dt = 0

Подставив это в дифференциальное уравнение, получим выражение для  концентрации свободного фермента:

[E] = (k_-1 + k₂) [ES] / k₁ [S]

[E]_T = [E] + [ES] = [(k_-1 + k₂) / k_-1 [S] + 1] [ES] =

= (k_-1 + k₂ + k_-1[S]) / k₁ [S] [ES]

Уравнение стационарного  состояния:

[ES] = k₁ [S] [E]_T / (k_-1 + k₂ + k₁[S])

Т.к. v = k₂ [ES], то получим, что

v = k₁ k₂ [S] [E]_T / (k_-1 + k₂ + k₁[S]) = k₂ [S] [E]_T / [(k_-1 + k₂) / k₁ + [S]]

В этом случае

V_max = k₂ [E]_T

и равняется максимальной скорости, полученной по уравнению  Михаэлиса - Ментен. Тем не менее, константа в знаменателе уравнения Михаэлиса - Ментен - не K_S, т.е. не константа диссоциации фермент-субстратного комплекса, а так называемая константа Михаэлиса:

K_m = (k_-1 + k₂) / k₁

K_m равно K_S только, если .

В случае константа в знаменателе  уравнения скорости выражается формулой

K_k = k₂ / k₁

и называется, согласно Ван  Слайку, кинетической константой. 

Уравнение стационарного  состояния можно также получить из дифференциального уравнения  без предположения, что d [ES] / dt = 0. Если подставим значение [E] = [E]_T - [ES] в дифференциальное уравнение, после преобразований получим

[ES] = (k₁ [S] [E]_T - d [ES] / dt) / (k₁ [S] + k_-1 + k₂)

Для того чтобы из этого  уравнения получить уравнение стационарного  состояния, не обязательно должно быть d [ES] / dt = 0. Достаточно, чтобы выполнялось неравенство d [ES] / dt << k₁ [S] [E]_T. Этим объясняется, почему можно достичь хорошего приближения в течение длительного времени при использовании принципа стационарности.

Дифференцированное уравнение  стационарного состояния выглядит следующим образом:

d [ES] / dt = [k₁ (k_-1 + k₂) [E]_T / (k₁ [S] + k_-1 + k₂)²] (d [S] / dt)

Это выражение, очевидно, не равно 0.

Природа компонентов реакции  не определяет целиком смысла константы K в уравнении. Величина K_m не имеет строго фиксированного значения. Она может меняться в зависимости от структуры субстрата, от рН и от температуры. При изменении условий реакции значение K также может измениться. Так, например, в случае пероксидазы при высокой концентрации донора протонов эта константа является кинетической константой K_k. При уменьшении концентрации донора протонов константа превращается в константу Михаэлиса K_m, а при очень низких уровнях донора протонов получаем константу диссоциации K_S. 

1.2 Преобразование уравнения Михаэлиса - Ментен

Исходное уравнение Михаэлиса - Ментен является уравнением гиперболы, где одна из констант (V_max) - асимптота к кривой. Другая константа (K_m), отрицательное значение которой определяется второй асимптотой, равна концентрации субстрата, необходимой для достижения V_max / 2. В этом легко убедиться, так как если

v=V_max / 2, то

V_max / 2 = V_max [S] / (K_m + [S])

V_max / V_max = 1 = 2 [S] / (K_m + [S])

K_m + [S] = 2 [S], т.е. [S] = K_m при v = V_max/2.

Уравнение Михаэлиса - Ментен можно алгебраически преобразовать в другие формы, более удобные для графического представления экспериментальных данных. Одно из наиболее распространенных преобразований сводится просто к тому, что приравнивают друг другу величины, обратные левой и правой части уравнения т.е.в результате преобразования получаем выражение

которое носит название уравнения Лайнуивера-Бэрка. Согласно этому уравнению, график, построенный в координатах 1/[S] и 1/v, представляет собой прямую, тангенс угла наклона которой равен K_m/V_max, а отрезок, отсекаемый на оси ординат, равен 1/V_max. Такой график, построенный по методу двойных обратных величин, имеет то преимущество, что он даёт возможность более точно определить V_max; на кривой, построенной в координатах [S] и v, V_max является асимптотической величиной и определяется значительно менее точно. Отрезок, отсекаемый на оси абсцисс, на графике Лайнуивера-Бэрка равен -1/K_m. Из этого графика можно также извлечь ценную информацию, касающуюся ингибирование фермента. 

Другое преобразование уравнения  Михаэлиса-Ментен состоит в том, что обе части уравнения Лайнуивера-Бэрка умножают на V_max*v и после некоторых дополнительных преобразований получают

Соответствующий график в  координатах v и v/[S] представляет . Такой график (график Эди-Хофсти) не только даёт возможность очень просто определить величины V_max и K_m, но и позволяет выявить возможные отклонения от линейности, не обнаруживаемые на графике Лайнуивера-Бэрка.

Уравнение также можно  линеаризовать в другой форме

[S] / v = K_m / V_max + [S] / V_max

В этом случае следует строить  зависимость [S] / v от [S]. Наклон полученной прямой равен 1 / V_max; отрезки, отсекаемые на осях ординат и абсцисс, равны (K_m / V_max) и (- K_m) соответственно. По имени автора этот график называют графиком Хейнса. 

Статистический анализ показал, что методы Эди - Хофсти и Хейнса дают более точные результаты, чем метод Лайнуивера - Берка. Причиной этого является то, что в графиках Эди - Хофсти и Хейнса и зависимые, и независимые переменные входят в величины, откладываемые на обеих осях координат.