Помимо оснований эксцизионная
репарация удаляет и нуклеотиды.
Этим механизмом из ДНК вырезаются
индуцированные УФ-лучами пиримидиновые
димеры. Следует отметить, что длительное
время основным способом такой
репарации считали выщепление
димеров в результате совместного
действия эндонуклеаз, осуществляющих
одноцепочечный надрез (инцизию)
вблизи димера, и экзонуклеаз,
вырезающих более или менее
протяженный участок цепи, содержащий
димер. Последующее восстановление
интактности молекулы ДНК достигается
путем закрывания бреши в ходе
репаративного синтеза недостающего
участка цепи с помощью ДНК-полимеразы
I, использующей противоположную
цепь как матрицу. Эта классическая
схема в недавнее время пересмотрена.
При исследованиях этапа инцизии,
проведенных на бактериях Micrococcus
luteus, было обнаружено, что ответственный
за этот этап фермент УФ-эндонуклеаза
обладает двумя видами активности.
Первая из них, ДНК-гликозилазная,
специфичная в отношении пиримидиновых
димеров (ПД-ДНК-гликозилаза), расщепляет
N-гликозильную связь между 5?-пиримидином
димера и соседним основанием.
Вторая, АП-эндонуклеазная, разрывает
сахарофосфатный каркас. Подобная
бифункциональность присуща и
УФ-эндонуклеазе, кодируемой геном
den V фага Т4.
В клетках Е.coli выщепление
пиримидиновых димеров контролируется
тремя генами uvr (от англ. ultraviolet radiation)
- А, В и С, кодирующими три
связывающихся с ДНК белка,
которые только совместно обладают
активностью УФ-эндонуклеазы. Фермент,
называемый эксцизионной нуклеазой
UVRABC, надрезает ДНК вблизи димера, содержащего
тимин. Один надрез находится на расстоянии
7 нуклеотидов от 3?-конца, другой - 5-6 нуклеотидов
от 5?-конца. В результате нуклеаза UVRABC
удаляет из поврежденной ДНК 12-13 нуклеотидов
вместе с пиримидиновым димером. Образовавшийся
пробел в ходе репаративного ресинтеза
заполняется ДНК-полимеразой, а целостность
сахарофосфатного каркаса ДНК восстанавливается
ДНК-лигазой. Подобный мультиферментный
комплекс выявлен и у других бактерий,
а также у дрожжей. Наряду с вырезанием
тиминовых димеров нуклеаза UVRABC, ДНК-гликолиазы
и др. ферменты с эндонуклеотической активностью
принимают участие в репарации ДНК.
Действие эксцизионной
репарации проявляется и в
отношении ДНК с АП-сайтами.
Такие сайты образуются спонтанно
в случае тепловых флуктуаций
в молекуле ДНК, приводящих
к потере модифицированных оснований;
при действии ионизирующей радиации
и алкилирующих агентов; при
репарации ДНК с участием ДНК-гликозилаз.
В отсутствие репарации накопление
в ДНК АП-сайтов может привести
клетку к гибели, т.к. они не
обладают кодирующими свойствами
и препятствуют в основном
безошибочной репликации ДНК.
Показано, что число ошибок, возникающих
при синтезе новой цепи ДНК
с помощью ДНК-полимеразы I на
матрице ДНК, содержащей АП-сайты,
увеличивается в 3-6 раз.
Известны два пути
эксцизионной репарации: короткими
участками и длинными участками.
Первый из них более эффективный
и быстрый. У E. coli основной фермент,
ведущий репаративный синтез
ДНК короткими участками, - ДНК-полимераза
I. С помощью этого типа ресинтеза
репарируется до 99% пробелов, возникающих
в результате вырезания участка,
содержащего повреждения. Величина
ресинтезированного фрагмента составляет
13-24 нуклеотида, что близко к размеру
олигонуклеотида, удаляемого нуклеазой
UVRABC. Присущая ДНК-полимеразе I, помимо
полимеразной, 5?-3?-экзонуклеазная активность
не участвует в самом выщеплении
фрагмента ДНК, несущего повреждения,
как это предполагалось ранее,
а обеспечивает формирование
разрывов в ДНК, представляющих
собой субстраты для последующего
действия ДНК-лигазы, сшивающей сахарофосфатный
каркас на завершающем этапе
репарации.
ДНК-полимераза I - полифункциональный
фермент. Мутации в гене polA, кодирующем
ДНК-полимеразу I у E. coli, значительно
увеличивают чувствительность клеток
к летальному действию УФ-лучей,
ионизирующей радиации, алкилирующих
агентов.
У E. coli помимо ДНК-полимеразы
I в репаративном синтезе ДНК
участвуют ДНК-полимеразы II и III.
Установлено, что ДНК-полимераза
II участвует в репаративном синтезе
длинными фрагментами при эксцизионной
репарации и в пострепликативной репарации
ДНК в УФ-облученных клетках. В основном
же репаративный синтез длинными фрагментами
длиной 1000-1500 нуклеотидов в УФ-облученных
клетках E. coli ведет ДНК-полимераза III. Этот
путь обеспечивает репарацию около 1% пробелов,
возникающих в ходе эксцизионной репарации.
Помимо ДНК-полимеразы III еще несколько
ферментов одновременно участвует в репарации
и вегетативной репликации ДНК. К ним,
в частности, относятся праймаза, обеспечивающая
синтез РНК-затравки, необходимой для
инициации репликации ДНК и синтеза фрагментов
Оказаки, белки, участвующие в расплетении
двухцепочечной ДНК (ДНК-хеликазы, белок
SSB, ДНК-гираза и некоторые другие).
Способность эксцизионной
репарации обнаружена не только
у бактерий, но и у двухцепочечных
фагов. Известна она и у эукариот.
У млекопитающих показателем
эксцизионной репарации служит
“внеплановый” синтез ДНК вне
периода S клеточного цикла во
время нормальной полуконсервативной
репликации хромосомы. Способность
к репарации ДНК нарушена у
лиц с наследственным заболеванием
- пигментной ксеродермой - болезнью,
при которой солнечное облучение
приводит к развитию злокачественной
опухоли кожи. Установлено, что
у некоторых из этих больных
подавлена активность УФ-эндонуклеазы,
у других - ДНК-полимеразы I. Клетки
больных первого типа, культивируемые
in vitro, не способны к удалению
димеров из ДНК, а клетки
больных второго типа не могут
репарировать ДНК, содержащую
одноцепочечные разрывы.
В процессе эксцизионной
репарации устраняется основная
доля предмутационных повреждений
ДНК, индуцированных УФ-лучами, поскольку
субстратом ее действия служат
не только циклобутановые димеры
тимина, но и (6-4) УФ-фотопродукты
цитозина. Последующий репаративный
ресинтез ДНК обычно безошибочен
и ведет к восстановлению исходной
последовательности ДНК. Восстановление
нормальной структуры ДНК, содержащей
сравнительно небольшое число
димеров, оставшихся в ней после
того, как исчерпались возможности
фотореактивации и эксцизионной
репарации, осуществляется в ходе
пострепликативной репарации.
Пострепликативная репарация
(ПРР)
Этот способ восстановления
целостности ДНК заключается
в репарации пробелов, образующихся
в дочерних цепях напротив не удаленных
в ходе репликации димеров. Основная
часть таких пробелов репарируется
путем рекомбинационных обменов
между двумя сестринскими дуплексами.
При этом до 50% УФ-индуцированных димеров
переносятся из родительской ДНК
в дочернюю. В клетках E. coli процесс
ПРР контролируется, по крайней мере,
17 генами.
Известны два пути
рекомбинационной репарации пострепликативных
пробелов в ДНК, совпадающих
с путями, осуществляющими у E.
coli рекомбинацию между ДНК донора
и реципиента при конъюгации,
трансформации и трансдукции.
Основным является путь RecBC, запасным
- путь RecF. Оба они контролируются
геном recA. Пробелы в дочерних
цепях заполняются в результате
рекомбинации, а пробелы в родительских
цепях - путем репаративного синтеза,
осуществляемого ДНК-полимеразами
I либо III. В отсутствие их обеих
ресинтез идет под действием
ДНК-полимеразы II. Другой путь ПРР
использует механизм реципрокной
рекомбинации, в результате которой
димер оказывается в дочернем
дуплексе, а пробел напротив него
- в родительском. Этот путь включает:
1) образование двунитевых разрывов
вследствие случайных разрывов
рядом с димерами в родительских
цепях; 2) реципрокные рекомбинационные
обмены между двумя сестринскими
дуплексами в гомологических
областях; 3) завершение рекомбинации
с образованием ДНК, свободной
от повреждений.
Оба типа рекомбинационной
репарации ДНК осуществляются
ферментами, действующими конститутивно,
и в зависимости от вида
бактерий репарируют от 30 до 100% пострепликативных
пробелов.
Индуцируемая репарация
SOS-репарация. М. Радман
(1974) и Э. Виткин (1975) первыми указали
на возможную взаимосвязь нескольких
феноменов, наблюдаемых в УФ-облученных
клетках E. coli. К ним относятся:
1) индукция профага ? - процесс,
требующий инактивации репрессора;
2) феномен W-реактивации, открытый
Дж. Вейглем (1953) и выражающийся
в повышении выживаемости и
мутабильности УФ-облученного фага
? при заражении им предварительно
облученных клеток E. coli по сравнению
с выживаемостью фага в необлученных
клетках; 3) образование длинных нитей
(филаментов) неразделившихся бактерий
вследствие блокирования нормального
процесса клеточного деления
в облученных клетках; 4) выключение
клеточного дыхания; 5) индукция мутагенеза,
и ряд других.
Способность клетки
реагировать на повреждения ДНК
или прекращение ее синтеза
путем активации группы генов,
контролирующих перечисленные выше
феномены, получила название SOS-ответа.
Одна из форм SOS-ответа - SOS-репарация
ДНК. Помимо УФ-облучения сигналами
на включение SOS-репарации могут
служить и другие воздействия,
повреждающие ДНК.
В случае УФ-облучения
индукция SOS-репарации у E. coli происходит
тогда, когда в геноме находится
не менее 30-60 невырезанных димеров.
Возникающая задержка репликации,
по-видимому, активирует группу генов,
продукты которых обеспечивают SOS-репарацию
ДНК. Ее характерная черта - неточность
восстановления первичной структуры ДНК,
поэтому такой тип репарации называют
“склонной к ошибкам” в отличие от относительно
безошибочной эксцизионной репарации.
По мнению ряда исследователей,
в основе SOS-репарации лежит индукция
новой или модификация одной
из предсуществующих ДНК-полимераз,
обеспечивающих возможность “трансдимерного”
синтеза ДНК, в результате которого
напротив димера будет находиться
не брешь, а какой-то нуклеотид.
Такая произвольная подстановка
нуклеотида во вновь образующуюся
нить может привести к мутации.
Прямые доказательства этой гипотезы
отсутствуют, однако существование
мутагенной репарации выявлено
у фага Т4 и грибов, различных
видов дрожжей, у D. melanogaster. Обнаружена
она и у млекопитающих, для
которых установлено, что пострепликативные
бреши действительно могут заполняться
за счет синтеза ДНК, а не
в результате рекомбинации. Примечательно,
что в отличие от конститутивной
безошибочной эксцизионной репарации
SOS-репарация сопряжена с синтезом
белка de novo и происходит в богатой
питательной среде. Это соответствует
условиям, ведущим к фиксации
мутаций в УФ-облученных клетках
E. coli.
Общее свойство всех
SOS-ответов у E. coli - их абсолютная
зависимость от активности генов
recA и lexA. Первый из них кодирует
синтез белка-индуктора SOS-системы,
второй - белка-репрессора гена recA и
ряда других генов, кодирующих
SOS-функции. Продукт гена recA - RecA-белок-
полипептид (Мr 37 842), обладающий несколькими
формами ферментативной активности.
Главная для регуляции SOS-ответа
- протеолитическая: RecA расщепляет или
стимулирует аутопереваривание
белка LexA и репрессоров генов
ряда SOS-функций, например репрессора
фага ?, поддерживающего его в
состоянии профага. Помимо протеазной
активности RecA-белок обладает еще
и АТФ-азной и хеликазной формами
активности, важными для его участия
в процессах рекомбинации и
рекомбинационной ПРР ДНК. При
отсутствии индуцирующих воздействий
исходный сравнительно низкий
уровень белка RecA в клетках
E. coli составляет 800-1200 молекул на
клетку. Однако в условиях индукции
SOS-системы синтез белка RecA резко
усиливается и может достигнуть
30% от общего содержания белка
в клетке. Другой важнейший для
функционирования SOS-системы ген
- lexA, - кодирует белок с Мr 22 700.
Ключевую роль в
регуляции SOS-системы играет взаимодействие
белков RecA и LexA. В интактной клетке
исходный уровень белка RecA обеспечивает
рекомбинацию, но его недостаточно
для индукции SOS-функций. В неповрежденной
клетке возможность избыточной
продукции белка RecA подавлена
(репрессирована) белком LexA. Повреждения
ДНК активируют RecA-протеазу, переваривающую
LexA-репрессор. Это, в свою очередь,
приводит к индукции других
генов SOS-системы, репрессоры которых
также расщепляются белком RecA. По
мере того как количество молекул
RecA-протеазы исчерпывается, вновь синтезируется
интактный LexA-репрессор и вся SOS-система
выключается. Из этой модели следует, что
SOS-система является саморегулирующейся,
причем белок RecA ее позитивный, а белок
LexA - негативный регулятор. Таким образом,
SOS-ответ клетки складывается из следующих
этапов: индуцирующий сигнал, синтез RecA-белка
и его активация, разрушение репрессоров
и индукция SOS-функций.
По мере репарации
ДНК факторы, индуцирующие SOS-ответ,
элиминируются и в течение
30-60 мин после индуцирующего воздействия
RecA-протеаза инактивируется. Синтез
белка LexA, однако, продолжается и,
так как теперь ничто не
мешает его функционированию, происходит
репрессия генов SOS-системы. Клетка
возвращается в неиндуцированное
состояние.
Из почти 20 генов,
контролирующих SOS-функции клетки
у E. coli, для мутагенеза существенны
лишь гены recA, lexA и состоящий из
двух генов оперон umuDC. Мутации
в любом из генов этого оперона
подавляют мутагенез, индуцированный
УФ-лучами, метилметансульфонатом и
другими видами воздействия. В
случае повреждения ДНК RecA-протеаза
расщепляет репрессор оперона
umuDC и последний начинает функционировать.
Предполагается, что продукты, кодируемые
генами umuDC, каким-то образом модифицируют
клеточные ДНК-полимеразы, в результате
чего они осуществляют синтез
ДНК в обход димеров пиримидина.
Адаптивный ответ. Помимо
SOS-репарации в клетках E. coli действует
еще один путь индуцируемой
репарации ДНК, называемый адаптивным
ответом на действие алкилирующих
агентов. В отличие от SOS-репарации
адаптивный ответ recA - независим.
Адаптивный ответ наблюдается
в случае, если клетки до обработки
основной, большой, дозой алкилирующих
агентов (например, нитрозогуанидина
либо N-метил-N-нитрозомочевины) подвергаются
воздействию очень низких, нелетальных
доз тех же соединений. Предобработка
бактерий низкими дозами алкилирующих
агентов обусловливает индукцию
ферментов репарации, специфично
действующих на алкилирование
ДНК. Один из этих ферментов
- индуцируемая О6-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза
- переносит метильную группу
с О6-метилгуанина (основного предмутационного
повреждения в алкилированной
ДНК) на остаток цистеина, входящий
в состав самого фермента, и
тем самым непосредственно исправляет
повреждение ДНК. Другой фермент
- индуцируемая ДНК-гликозилаза -
удаляет ряд потенциально летальных
повреждений в ДНК, включая
3-метиладенин, 3-метилгуанин и др.