Мутационный процесс

 

 

 Помимо внутри- и внегенной  известны и некоторые другие  типы супрессии. Один из них  - фенотипическая супрессия, примером  которой служит способность стрептомицина  подавлять проявление мутаций  к ауксотрофности у E. coli. Показано, что этот эффект осуществляется  на уровне трансляции и связан  с тем, что стрептомицин, воздействуя  на рибосомы, повышает вероятность  ошибок при считывании иРНК. Некоторые  такие ошибки приводят к подстановке  “неправильной” аминокислоты, восстанавливающей,  однако, функцию фермента, обеспечивающего  прототрофность бактерий по данному  признаку (например, потребности для  роста в определенной аминокислоте). Ясно, что подобная супрессия  не должна наследоваться, поскольку  не затрагивает генотип мутанта.

 Рассмотренные возможности  образования прямых и обратных  мутаций относятся как к спонтанным, так и к индуцированным мутациям. Вместе с тем каждый из этих  типов мутаций имеет свои закономерности  и особенности, более подробно  изученные в случае индуцированного  мутагенеза.

 

 

 

Индуцированный мутагенез

 

Открытие мутационного процесса в начале ХХ века положило начало всестороннему  изучению причин и механизмов наследственной изменчивости как общебиологического явления, присущего всем живым организмам. Естественным было желание воздействовать на этот процесс для повышения  его эффективности. Успеху искусственного получения мутаций способствовали три обстоятельства: 1) выявление  мутагенного действия рентгеновских  лучей на хромосомы половых клеток; 2) обнаружение систем, позволяющих  отличить хромосомные мутации от повреждений митотического аппарата клеток либо каких-то компонентов цитоплазмы; 3) разработка методов количественного  учета вновь возникающих мутаций.

 

 

Мутагенное действие ионизирующих излучений

 

Первая успешная попытка  изменить наследственность под действием  радиации была предпринята Г.А. Надсоном и Г.С. Филипповым (1925), облучавших дрожжи препаратом радия. Поскольку генетика дрожжей в то время была совершенно не изучена, авторы этой работы не смогли доказать, что в основе отобранных ими новых форм лежит индукция наследуемых мутаций. Однако вскоре Г. Меллер (1927) на дрозофиле, а затем  Л. Стадлер (1928) на ячмене и кукурузе убедительно продемонстрировали мутагенное действие рентгеновского излучения. Этому  способствовала разработка надежных методов  выявления сцепленных с полом  летальных мутаций, а также видимых  мутаций и крупных делеций.

 

 

 Для идентификации  летальных мутаций Меллер вывел  такую линию D. melanogaster, самки которой  содержали одну нормальную, а  другую мутантную Х-хромосому.  Мутантную хромосому он обозначил  символом CIB. Она представляет собой  протяженную инверсию, блокирующую  кроссинговер между Х-хромосомами  (“запиратель кроссинговера”). Отсутствие  кроссинговера, с одной стороны,  сохраняет все особенности хромосомы  CIB, а с другой - препятствует переходу  гена, в котором индуцирована  летальная мутация, в хромосому  CIB. I - рецессивная летальная мутация,  которая может проявиться практически  только в гемизиготном состоянии.  В - сигнальная мутация (полосковидные  глаза), по которой опознают самок-носительниц  хромосомы CIB. Меллер облучал рентгеновскими  лучами нормальных самцов и  скрещивал их с самками CIB. Половина  самок, полученных от такого  скрещивания, будет нести хромосому  CIB, тогда как другая половина - нормальную Х-хромосому. Вторая  Х-хромосома у всех самок - облученная  Х-хромосома самца-родителя. Для  получения потомства F2 скрещивают  самок CIB с нормальными самцами.  В результате половина самцов F2 получают хромосому CIB, а вторая  половина - облученную Х-хромосому.  Если эта хромосома содержит  рецессивную летальную мутацию,  то в F2 вообще не будет самцов. Напротив, отсутствие летальной  мутации приводит к появлению  в F2 потомства с соотношением  самцов и самок 1:2. Таким образом,  присутствие или отсутствие индуцированных  облучением рецессивных, сцепленных  с полом мутаций можно легко  распознать по присутствию или  отсутствию самцов в потомстве  от второго скрещивания.

 

 

 Другой разработанный  Меллером метод (Меллер-5) позволяет  учитывать как летальные, так  и видимые мутации. Хромосома  Меллер-5 (М5) не содержит летальных  мутаций, и поэтому самки могут  быть гомозиготны по этой хромосоме.  Кроме того, хромосома М5 содержит  две инверсии, которые более надежно,  чем в случае CIB, запирают кроссинговер. В хромосоме М5 также имеется  ряд сигнальных генов: y, sc, wap. В  случае индукции в Х-хромосоме  самцов рецессивных летальных  мутаций в F2 соотношение самок  и самцов становится 2:1.

 

 

 Учет рецессивных видимых  мутаций, возникающих в Х-хромосоме  самцов, проводится методом сцепленных  Х-хромосом. Линия дрозофил с такими  Х-хромосомами была получена Т.  Морганом. Самки этой линии имеют  сцепленные Х-хромосомы и дополнительно  Y-хромосому. Обычно сцепленные  Х-хромосомы в гомозиготном состоянии  несут рецессивную аллель у  (от англ. yellow - желтый). Благодаря  этому все самки со сцепленными  Х-хромосомами имеют желтое тело, тогда как самцы - нормальную  серую окраску. Гаметы таких  самок содержат либо две сцепленные  Х-хромосомы, либо одну Y-хромосому.  При оплодотворении их облученным  самцом возникают следующие комбинации: ХХХ - нежизнеспособные “сверхсамки”, XY - самцы, получившие Y-хромосому  от матери, а Х - от отца, XXY - самки со сцепленными Х-хромосомами, YY - леталь. Если в Х-хромосоме  облученного отца возникает видимая  мутация, ее легко выявить по  появлению в F1 самца с необычным  признаком среди массы нормальных  самцов, легко отличимых от самок  по окраске тела.

 

 

 Используя метод CIB, Меллер обнаружил, что рентгеновское  облучение самцов стократно увеличивает  частоту образования рецессивных  летальных мутаций. С помощью  методов сцепленных Х-хромосом  и Меллер-5 было установлено, что  рентгеновское облучение индуцирует  не только летальные, но и  видимые мутации, а также большие  делеции. Вслед за работами  Меллера на дрозофиле и Стадлера  на ячмене и кукурузе, Н. В.  Тимофеев-Ресовский, К. Циммер, Дж. Ли, М. Демерец, К. Штерн, А.  С. Серебровский и другие исследователи  начали интенсивное изучение  мутагенного действия радиации  на дрозофиле, различных растениях  и микроорганизмах. Эти работы  положили начало радиационной  генетике.

 

 

 Разработка методов  количественной оценки мутаций,  индуцированных рентгеновскими  лучами, и выявление мутагенности  их действия на разных объектах  позволили понять общие черты  мутационного процесса, вызванного  облучением. Были установлены следующие  факты: 1) действие ионизирующей радиации  как мутагенного фактора имеет  универсальный характер и проявляется  на всех биологических объектах; 2) мутационный процесс, вызванный  ионизирующим облучением, ненаправленный, т.е. может затрагивать любые  признаки организма и носит  статистический характер; 3) радиация  индуцирует те же типы мутаций,  которые возникают и при спонтанном  мутагенезе.

 

 

 К ионизирующим относятся  рентгеновские, ?- и космические лучи. Рентгеновские лучи с длиной  волны 0,1-1 нм обладают высокой  энергией, позволяющей им проникнуть  внутрь живых тканей. При этом  энергия этих лучей и других  типов ионизирующих излучений  поглощается непосредственно компонентами  клетки, с которыми они сталкиваются, в том числе молекулами ДНК.

 Существенно, что дозирование  излучения не учитывает фактора  времени. Это означает, что одна  и та же доза может быть  получена при слабой интенсивности  облучения в течение длительного  времени либо путем кратковременного  облучения с высокой интенсивностью.

 

 

 Как было установлено  с помощью методов количественного  учета мутаций у дрозофилы,  кривые “доза-эффект” для сцепленных  с полом рецессивных леталей  и видимых (морфологических) мутаций  носят линейный характер. Это  означает, что частота индуцированных  генных мутаций пропорциональна  дозе облучения. Своеобразие радиобиологических  кривых зависимости эффекта от  дозы - отсутствие порога и постепенное  нарастание до насыщения начиная  с самых малых доз. Такой  характер кривых отражает не  только усиление степени поражения  с возрастанием дозы, но и увеличение  вероятности поражения: даже самые  малые дозы ионизирующей радиации могут привести к гибели клетки и возникновению летальных мутаций, но лишь у небольшого числа особей. Этот вывод имеет важное значение при оценке допустимых доз радиации и опасностей, связанных с облучением.

 Линейный характер  зависимости частоты генных мутаций  от дозы указывает, что они  образуются одномоментно, т.е. один  акт ионизации, возникающий вдоль  пути следования вторичных электронов, вызывает мутацию. В радиобиологии  такой акт ионизации называют  “ударом”. Теория “удара”, созданная  в 20-х годах, вскоре была  модифицирована и легла в основу  теории “мишени”, согласно которой  возникновение генных мутаций,  мелких делеций и одиночных  разрывов хромосом под действием  ионизирующей радиации - следствие  одиночных ударов, причем повреждение  происходит непосредственно в  том месте, где возникает первичная  ионизация, а вся реакция протекает  внутри определенного объема (“мишени”), т.е. в самом гене либо в  непосредственной близости к  нему. Частота указанных изменений  линейно зависит от дозы и  не зависит от ее мощности (т.е.  количества радиации в единицу  времени) и от жесткости излучения  (определяемой длиной волны).

 

 

 В отличие от генных  мутаций и простых делеций  частота обменных перестроек  хромосом под действием рентгеновского  и ?- облучения возрастает примерно  пропорционально квадрату дозы. При этом одноударная кривая  зависимости числа мутаций от  дозы облучения меняется на S-образную, многоударную. Теория мишени объясняет  это тем, что указанные виды  облучения характеризуются низкой  величиной линейного переноса  энергии (т.е. плотности создаваемой  ими вдоль треков движения  луча). Поэтому акты ионизации  вдоль треков редки и каждый  из них не зависит от другого.  Отсюда следует, что акт ионизации  (один “удар”) достаточен для  того, чтобы возникла генная мутация  или один разрыв хромосомы,  но для двух разрывов хромосомы,  ведущих к хромосомным аберрациям, требуется два “удара”. Поскольку  они возникают независимо, вероятность  их попадания в одну хромосому  является произведением вероятностей  для каждого из них, что и  составляет основу зависимости  частоты хромосомных перестроек  от квадрата дозы облучения.  В отличие от рентгеновских  и ?-лучей нейтроны и ?-частицы,  характеризующиеся высоким значением  линейного переноса энергии, дают  плотную ионизацию в пределах  одного трека. Вероятность возникновения  двух разрывов хромосомы значительно  увеличивается, поэтому кривые  зависимости частоты хромосомных  аберраций от дозы облучения  соответствует кинетике первого  порядка.

 

 

 Теория мишени сыграла  значительную роль в развитии  радиационной генетики. Вместе с  тем был получен ряд новых  фактов, для объяснения которых  одной этой теории оказалось  недостаточно. Выяснилось, что радиационные  повреждения генетического материала  являются не прямыми, а лишь  потенциальными источниками возникновения  мутаций, поскольку процесс индуцированного  мутагенеза непосредственно связан  с метаболизмом поврежденной  клетки, в которой действуют различные  системы репарации, т.е. восстановления  интактной структуры ДНК. С  репарацией связан, в частности,  не вполне объяснимый теорией  мишени факт, заключающийся в  том, что фракционирование дозы  рентгеновского облучения уменьшает  частоту хромосомных перестроек, но, как отмечалось выше, не влияет на образование генных мутаций и мелких делеций. Очевидно, что если одна и та же доза радиации дается не сразу, а в несколько приемов, то часть индуцированных облучением разрывов хромосом успеет отрепарироваться с восстановлением интактной структуры ДНК до того, как очередной акт ионизации приведет к возникновению новых одиночных разрывов. Это вызовет уменьшение числа множественных разрывов и, следовательно, снизит вероятность крупных перестроек хромосом.

 

 

 Вторая группа фактов, не учитываемых теорией мишени, по крайней мере, в ее первоначальной  форме, связано с возможностью  не только прямого, но и непрямого  действия радиации. Коррективы в  теорию мишени пришлось внести  после обнаружения того факта,  что в присутствии воды рентгеновские  лучи не только прямо “ударяют”  по чувствительным к ним генетическим  структурам, но и действуют на  них косвенно за счет разложения  воды - радиолиза. Этот процесс  приводит к образованию реакционноспособных  короткоживущих свободных радикалов  - водорода Н и гидроксила ОН, объединяющихся с образованием  воды, атомарного кислорода О2  либо химически активной перекиси  водорода Н2О2.

 

 

 Поэтому облучение  молекул-мишеней в присутствии  соединений, способных взаимодействовать  со свободными радикалами, защищает  молекулы-мишени от непрямого  действия радиации. К ним, в  частности, относятся соединения  серы, действующие как “ловушки”  радикалов и различные антиоксиданты,  обуславливающие восстановление  радикалов.

 

 

 Наиболее важный способ  воздействия на радиационное  повреждение биологических объектов - изменение парциального давления  кислорода. Так называемый кислородный  эффект носит универсальный характер  в том смысле, что при низком  парциальном давлении кислород  действует как радиопротектор, т.е.  снижает число повреждений, вызванных  радиацией. Вместе с тем, если  кислород присутствует в момент  облучения, он служит радиосенсибилизатором,  т.е. усиливает повреждающий и  мутагенный эффект. Выбор между  этими возможностями определяется  влиянием кислорода на образование  радикалов. Выявление роли радикалов  в непрямом действии радиации  придало точный физический смысл  одному из основных положений  теории мишени о том, что  генетические эффекты могут индуцироваться  процессами ионизации, как в  самой хромосоме, так и в  непосредственной близости от  нее. Наконец, третья группа  фактов, не укладывающихся в теорию  мишени, показывает, что эффективность  радиационного мутагенеза определяется  не только дозой либо ее  мощностью, не только условиями,  в которых клетки или целые  организмы подвергались облучению,  но и их биологической чувствительностью  к летальному и мутагенному  действию ионизирующих излучений,  поскольку для разных организмов  она неодинакова. Так, одна  и та же доза рентгеновских  лучей индуцирует у мыши примерно  в 10 раз больше мутаций, чем  у дрозофилы, и почти в 100 раз больше, чем у бактерий. Из  этих данных ясно, что видовые  различия в чувствительности могут заметно варьировать. Отсюда следует, что частоту мутаций необходимо определять с учетом видовых различий организмов. Следует также иметь в виду, что скорость возникновения индуцированных мутаций зависит от чувствительности клеток на разных стадиях клеточного цикла.